【摘要】：隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平的不斷提高,越來越多的藥物及個(gè)人護(hù)理品類化合物(PPCPs)被人們用于日常生活。研究指出,這類物質(zhì)攝入后會(huì)有大約50-90%被排出體外,而常見的污水處理技術(shù)分解能力有限,剩余的PPCPs會(huì)通過污水處理廠排水進(jìn)入環(huán)境。PPCPs的藥物機(jī)理又使其具有許多特殊的毒性效應(yīng),因而PPCPs污染正在受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。長(zhǎng)江河口區(qū)域毗鄰上海市,是中國(guó)人口最密集,工商業(yè)最發(fā)達(dá)的地區(qū)之一。上海市的污水主要向長(zhǎng)江河口區(qū)域近岸水體排放,這就造成了PPCPs在長(zhǎng)江河口近岸水體的持續(xù)輸入。在眾多的PPCPs污染物中,一些常用物質(zhì)的環(huán)境濃度已經(jīng)達(dá)到了較高的水平。鑒于可能存在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),有必要針對(duì)該區(qū)域一些典型的PPCPs污染物展開毒理學(xué)調(diào)查研究。基于已有數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道,本研究選擇了他莫昔芬(TAM)、雙酚A(BPA)、布洛芬(IBP)、雙氯芬酸(DCF)和對(duì)乙酰氨基酚(PRCT)這五種常見的PPCPs作為調(diào)查的目標(biāo)化合物。本研究首先利用斑馬魚胚胎/幼魚96小時(shí)急性毒性暴露實(shí)驗(yàn)作為研究方法,從形態(tài)學(xué)、行為學(xué)和分子生物學(xué)等角度,調(diào)查了這些污染物的毒性效應(yīng)。同時(shí),本研究以上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),篩選了一些表現(xiàn)出普遍性和代表性的毒理學(xué)指標(biāo),探討了這些指標(biāo)反應(yīng)相關(guān)環(huán)境污染情況的潛力。最后,本研究采集了長(zhǎng)江河口近岸水體的樣本,開展了環(huán)境水樣暴露實(shí)驗(yàn),分析了使用斑馬魚胚胎暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)合上述毒性指標(biāo)檢測(cè)的方法在表征環(huán)境水樣污染時(shí)的有效性,并利用檢測(cè)結(jié)果對(duì)長(zhǎng)江河口區(qū)域近岸水體的污染現(xiàn)狀和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估。在形態(tài)學(xué)調(diào)查中,本研究發(fā)現(xiàn)TAM在最高濃度下(500μg/L)對(duì)96 hpf斑馬魚幼魚產(chǎn)生了一定的致畸效應(yīng)。暴露組的幼魚體長(zhǎng)變短,有輕度尾鰭缺損、表皮變暗、心率也出現(xiàn)了下降。后續(xù)的基因表達(dá)檢測(cè)顯示與表皮修復(fù)相關(guān)的krt17和egf基因的表達(dá)在TAM暴露組中有所上升,說明尾鰭缺損和表皮變暗是由于TAM對(duì)表皮組織的損傷造成的。在行為學(xué)調(diào)查中,本研究發(fā)現(xiàn)IBP和DCF的暴露會(huì)造成受試斑馬魚胚胎/幼魚的行為發(fā)生變化。在28 hpf的胚胎早期自發(fā)運(yùn)動(dòng)檢測(cè)中,IBP和DCF的存在會(huì)導(dǎo)致胚胎自發(fā)運(yùn)動(dòng)頻率下降,降幅最高可達(dá)25%和28%。在48-60 hpf的胚胎孵化過程中,IBP和DCF暴露均能造成顯著的孵化延遲,其在55 hpf時(shí)期的平均孵化率比對(duì)照組低63%和58%。在120 hpf的游泳行為檢測(cè)中,IBP暴露會(huì)造成幼魚黑暗條件下的自由游泳距離、時(shí)間和速度分別下降41%、29%和30%。DCF暴露則會(huì)造成幼魚在光暗交替刺激下光照周期中的游泳距離和游泳時(shí)間均出現(xiàn)下降,降幅最高為17%和15%。在后續(xù)的基因檢測(cè)中,與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的neurod1和neurog1基因的表達(dá)在IBP和DCF作用下發(fā)生了變化。這些結(jié)果顯示IBP和DCF能改變斑馬魚胚胎/幼魚的行為,并具有潛在的神經(jīng)毒性效應(yīng)。在對(duì)內(nèi)分泌相關(guān)的基因進(jìn)行檢測(cè)的過程中,本研究發(fā)現(xiàn)TAM和BPA的暴露對(duì)斑馬魚胚胎/幼魚內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達(dá)有顯著的影響。在TAM暴露實(shí)驗(yàn)組中,斑馬魚幼魚體內(nèi)的esr1、cyp19a1b、ar、hsd3b2和ugt1a1基因的表達(dá)量均顯著升高,最高可達(dá)空白對(duì)照組的224%、2024%、153%、182%和154%,而vtg1基因的表達(dá)量則下調(diào)至空白對(duì)照組的71%。這些結(jié)果符合TAM選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)的身份。在BPA暴露實(shí)驗(yàn)組中,斑馬魚幼魚體內(nèi)的esr1、cyp19a1b、ar、vtg1和ugt1a1基因的表達(dá)量也顯著升高,最高可達(dá)空白對(duì)照組的188%、1554%、134%、141%和205%。這些結(jié)果符合BPA環(huán)境雌激素的身份。鑒于TAM暴露使具有重要的雌激素效應(yīng)的cyp19a1b基因的表達(dá)提高了20倍,所以本研究認(rèn)為,TAM在斑馬魚胚胎/幼魚的早期發(fā)育過程中,主要表現(xiàn)為雌激素效應(yīng)。在對(duì)代謝相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)的過程中,本研究發(fā)現(xiàn)所有的5種PPCPs都會(huì)不同程度的誘導(dǎo)斑馬魚胚胎/幼魚體內(nèi)的代謝相關(guān)基因的表達(dá),這反應(yīng)了PPCPs污染對(duì)斑馬魚胚胎/幼魚體內(nèi)代謝和抗氧化應(yīng)激體系的壓力。在這些基因中,I相代謝相關(guān)的cyp3a65基因的表達(dá)受所有5種PPCPs的誘導(dǎo)(最高達(dá)336%),反映了其在斑馬魚代謝PPCPs過程中的重要性和普遍性�？寡趸瘧�(yīng)激體系相關(guān)的gpx1a和gsr基因的表達(dá)也受所有5種PPCPs的誘導(dǎo)(最高達(dá)184%和147%),表明了這兩個(gè)基因?qū)?yīng)的GSH體系在斑馬魚對(duì)抗氧化應(yīng)激過程中的重要作用。此外,cyp1a、gstp1和cat基因也受到復(fù)數(shù)種PPCPs的誘導(dǎo)(最高達(dá)160%、140%和142%),表明其在代謝體系中也具有較為通用的作用。實(shí)驗(yàn)室暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,形態(tài)學(xué)指標(biāo)中的體長(zhǎng)、心率和畸形,行為學(xué)指標(biāo)中胚胎早期自發(fā)運(yùn)動(dòng)和孵化速度,以及esr1、cyp19a1b、ar、vtg1、cyp1a、cyp3a65、gpx1a、gstp1、gsr、gss、sod1和cat等基因的表達(dá)變化,都具有表征環(huán)境中PPCPs污染情況的潛力。在隨后的環(huán)境水樣暴露條件下,可以觀察到上述指標(biāo)不同程度的變化,這表明斑馬魚胚胎暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)合這些指標(biāo)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法可以用于表征低濃度的環(huán)境污染。利用上述實(shí)驗(yàn)方法和毒理學(xué)指標(biāo),本研究對(duì)長(zhǎng)江河口區(qū)域近岸水體的環(huán)境污染情況進(jìn)行了檢測(cè)。研究所用的水樣采集自瀏河口(LHK)、石洞口(SDK)和吳淞口(WSK)。在形態(tài)學(xué)檢測(cè)中,SDK區(qū)域的水樣造成了受試胚胎/幼魚35.83%的死亡率,以及幸存幼魚的發(fā)育不良。在行為學(xué)檢測(cè)中,LHK和SDK區(qū)域的水樣造成了胚胎早期自發(fā)運(yùn)動(dòng)頻率增加(113%和121%)和孵化時(shí)間的顯著提前(10h和14h)。內(nèi)分泌相關(guān)基因的檢測(cè)顯示3個(gè)區(qū)域的水樣都具有復(fù)雜的環(huán)境激素作用,LHK區(qū)域的水樣誘導(dǎo)了cyp19a1b和ar基因的表達(dá)(133%和143%);SDK區(qū)域的水樣誘導(dǎo)了esr1、cyp19a1b和vtg1基因的表達(dá)(183%、120%和143%),但抑制了ar基因的表達(dá)(80%);WSK區(qū)域的水樣則誘導(dǎo)了esr1和ar基因的表達(dá)(135%和123%)。代謝相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)則表明LHK和SDK區(qū)域的水樣對(duì)斑馬魚幼魚的代謝和抗氧化機(jī)制存在干擾作用,LHK區(qū)域的水樣誘導(dǎo)了cyp1a基因的表達(dá)(242%),但抑制了cyp3a65、gpx1a和sod1基因的表達(dá)(53%、77%和84%);SDK區(qū)域的水樣則廣泛的抑制了cyp3a65、gpx1a、gstp1、gsr、gss、sod1和cat基因的表達(dá)(10%、63%、77%、85%、83%、64%和44%)。這些結(jié)果表明,LHK、SDK和WSK區(qū)域的近岸表層水均存在明顯的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),長(zhǎng)江河口區(qū)域近岸水體的污染情況不容樂觀。
【圖文】：

圖 2-1 長(zhǎng)江河口區(qū)域地圖Fig. 2-1 Area map of the Yangtze River Estuary2.2 目標(biāo)化合物本研究對(duì)目標(biāo)物的篩選基于已有的文獻(xiàn)資料和本學(xué)院其他相關(guān)的調(diào)查數(shù)據(jù)。先前的調(diào)查表明，長(zhǎng)江口區(qū)域近岸水體中包含的 PPCPs 污染物種類繁多，但是多數(shù)物質(zhì)的濃度較低，僅有一些常見 PPCPs 的含量可以達(dá)到數(shù)十至數(shù)百 ng/L 的水平（Yang et al., 2011b；Shi et al. 2014；Wu et al., 2014；Zhao et al., 2015）。這些物質(zhì)對(duì) PPCPs 造成的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的整體貢獻(xiàn)較大。因此在篩選暴露實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)化合物時(shí)，本研究綜合考慮了上述調(diào)查數(shù)據(jù)、藥物的作用機(jī)理和已有的研究報(bào)道，最終選定以下 5 種 PPCPs 作為斑馬魚胚胎/幼魚急性毒性實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)化合物：他莫昔芬（TAM）、雙酚 A（BPA）、布洛芬（IBP）、雙氯芬酸（DCF）、對(duì)乙酰氨

圖 2-2 目標(biāo)化合物的離子色譜圖（使用 50 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)）Fig. 2-2 Chromatograms of target compounds in 50 μg/L standard solution2.3.8 數(shù)據(jù)分析本研究所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）的形式記錄。對(duì)于需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較的數(shù)據(jù)組，首先需要進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。行為學(xué)測(cè)試的一系列結(jié)果符合方差齊性，故對(duì)這些數(shù)據(jù)組的分析比較使用了單因素方差分析法（one-wayANOVA），后續(xù)兩兩比較使用了 Tukey 檢驗(yàn)。其余實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)組多數(shù)不符合方差齊性條件，故不適合使用 one-wayANOVA 進(jìn)行分析。但是這些數(shù)據(jù)組均符合正態(tài)分布，因此本研究使用了雙尾異方差 T 檢驗(yàn)來比較這些試驗(yàn)中處理組數(shù)據(jù)與對(duì)照組數(shù)據(jù)之間的差異。對(duì)于這兩種分析檢驗(yàn)，，本研究均選擇概率 P < 0.05 為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由 Origin 8.5 軟件處理分析。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X171.5

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本文編號(hào)：2676179