【摘要】：在本文的研究中，從自然界中分離獲得了一株具有降解聚-3-羥基丁酸[poly(3-hydroxybutyrate)，PHB]能力的菌株，通過對菌落的形態(tài)觀察、生理生化特性分析和16SrDNA的比對，發(fā)現該菌株與門多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina16SrDNA有100%的相似度，因此將該菌株命名為Pseudomonas mendocinaDSWY0601。該菌可以在PHB為唯一碳源的培養(yǎng)基上形成明顯的透明圈，也可以通過液體培養(yǎng)侵蝕PHB薄膜，使PHB薄膜逐漸被分裂破壞，最終將PHB薄膜降解為水溶性的3-羥基丁酸。 根據單因素試驗和正交試驗對P. mendocina DSWY0601菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，如碳源、氮源、磷源、pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、搖床轉速和裝液量等。優(yōu)化出的最佳產酶條件如下：培養(yǎng)基的碳含量為0.15%；氮含量為0.15%；磷含量為0.554%KH_2PO_4/1.194%Na_2HPO_4·12H_2O；培養(yǎng)溫度為35°C；培養(yǎng)基初始pH為8.5；培養(yǎng)時間為36h；搖床的轉速為200r/min。 通過離心、超濾、DEAE-Sepharose fast flow column和Phenyl Sepharose6fast flowcolumn等步驟純化出一個胞外PHB解聚酶，純化倍數為4.2，回收率為5.7%。通過SDS-PAGE蛋白電泳測得PHB解聚酶的分子量約為59.8kDa。該酶的最適反應溫度和pH分別為50°C和8.5，在溫度20~50°C和pH8.0~9.0范圍內酶的穩(wěn)定性最好。Mn~(2+0和Fe~(2+)對PHB解聚酶酶活力有輕微的抑制作用，而PMSF、H_2O_2和SDS對PHB解聚酶的酶活力有強烈的抑制作用，Tween20和Triton X-100對酶活力不存在明顯的抑制作用。PHB解聚酶的Km為0.172mg/mL。在底物特異性方面，，PHB解聚酶具有酯酶活性，而且除可以降解PHB外，還可以降解聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)和3-羥基-4羥基脂肪酸共聚酯(P3/4HB)，但對聚乳酸(PLA)、聚已內酯(PCL)及聚丁烯琥珀酸酯(PBS)沒有降解活性。PHB解聚酶降解PHB的主要產物為3-羥基丁酸，推測該解聚酶降解PHB的模式是一種外切酶的方式，每次都從端鏈切下一個3-羥基丁酸。 PHB解聚酶肽指紋圖譜的分析結果顯示該解聚酶與P. mendocina ymp基因組中預測的PHB解聚酶相似性較高。根據相關序列設計引物，克隆了來源于P. mendocinaDSWY0601的PHB解聚酶基因(phaZpm)，并通過誘導表達和Ni柱純化獲得了重組的PHB解聚酶。純化的重組PHB解聚酶分子量約為62.1kDa，最適反應pH和溫度分別為8.5和50°C。 同時對PHB解聚酶基因進行了序列分析，推測該酶的576個氨基酸序列中，含有一個位于N端由39個氨基酸殘基組成的信號肽，一個催化結構域，一個連接區(qū)和兩個C端的底物結合結構域；在催化結構域中，包含有酯酶保守的五肽box和催化三聯體結構。
【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：X172

【參考文獻】

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1 于慧敏,沈忠耀;可生物降解塑料聚-β-羥基丁酸酯(PHB)的研究與發(fā)展[J];精細與專用化學品;2001年08期

本文編號：2673185