【摘要】：本文以一株能大量合成胞外多糖熱凝膠的土壤桿菌31749 (Agrobacterium sp. ATCC 31749)為研究對象,在初步了解土壤桿菌31749胞內(nèi)碳源及氮源代謝的基礎(chǔ)上,運用代謝工程和微生物生理學(xué)的理論與方法,就氮代謝雙組分系統(tǒng)NtrB-NtrC調(diào)控土壤桿菌31749在氮源限制條件下合成胞外多糖的機(jī)理展開研究。主要研究結(jié)果如下: (1)采用RT-qPCR和2-DE技術(shù)研究了土壤桿菌31749氮源代謝調(diào)控系統(tǒng)和菌體總蛋白對氮源限制環(huán)境的應(yīng)答變化。結(jié)果表明,氮源限制條件可以顯著提高氮源代謝基因glnA、gltB、nifA及其相關(guān)調(diào)控基因ntrC、ntrB、ntrX、ntrY的相對轉(zhuǎn)錄水平,并將碳代謝流分配關(guān)鍵基因exoC的相對轉(zhuǎn)錄水平提高了14倍。蛋白質(zhì)二維電泳分析發(fā)現(xiàn),土壤桿菌31749在應(yīng)答環(huán)境氮源含量變化時,14個蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著提高,6個蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)。這20個蛋白質(zhì)中有4個被成功鑒定,分別為分子伴侶GroEL、未知蛋白Atu1730、ABC轉(zhuǎn)運蛋白和烯酰ACP還原酶。ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)水平的提高滿足菌體大量轉(zhuǎn)移糖類物質(zhì)的需求,烯酰ACP還原酶表達(dá)量的下調(diào)使菌體細(xì)胞壁合成受阻,而用于細(xì)胞壁合成的UDPG被主要用于熱凝膠的合成。 (2)利用同源重組原理構(gòu)建土壤桿菌31749的ntrC突變株ΔntrC,分析ΔntrC對氮源的應(yīng)答和利用情況。結(jié)果表明:ΔntrC對培養(yǎng)基中NH_4Cl和硝酸鉀的利用速度顯著減慢,但能正常利用谷氨酸和谷氨酰胺。無論ΔntrC利用這4種氮源中的任何一種,熱凝膠合成量均小于2.0 g/L。在以NH_4Cl為氮源的分批發(fā)酵過程中,ΔntrC的熱凝膠合成時間相對野生菌延遲15 h,最終發(fā)酵液熱凝膠含量為4.8 g/L,顯著的低于野生菌熱凝膠產(chǎn)量(25.7 g/L)。另外,ΔntrC在菌體形態(tài)變化速度上顯著不同于野生菌,其形態(tài)在對數(shù)生長期幾乎全是桿狀。通過分析ΔntrC和野生菌在生長期的總蛋白表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)43個蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生顯著變化,22個表達(dá)上調(diào),21個表達(dá)下調(diào)。43個蛋白質(zhì)中有4個表達(dá)量變化顯著的被成功鑒定,分別為鈷胺素生物合成蛋白、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶、核苷二磷酸激酶和N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脫氫酶。上述結(jié)果也證實最初假設(shè),即NtrC參與調(diào)控?zé)崮z的合成。 (3)利用同源重組原理進(jìn)一步構(gòu)建土壤桿菌31749的ntrB突變株ΔntrB,并分析ΔntrB對環(huán)境氮源應(yīng)答和利用情況。結(jié)果表明:ΔntrB對NH_4Cl的利用速度顯著減慢,但能正常利用硝酸鉀、谷氨酸和谷氨酰胺。以NH_4Cl為氮源的分批發(fā)酵過程中,ΔntrB氮源消耗時間延長5 h,但生物量對氮源得率(Y_(X/N))相比野生菌基本不變,仍維持在1.875 g/g的水平;而突變株ΔntrB合成熱凝膠的能力顯著削弱,熱凝膠產(chǎn)量僅為10.9 g/L。ΔntrB的菌體形態(tài)變化速度也較野生菌加快,但是變化速度沒有ΔntrC快。通過比較ΔntrC和ΔntrB特性發(fā)現(xiàn),NtrB并不是唯一能對NtrC進(jìn)行磷酸化的蛋白,可能存在其他的此類蛋白X,但是X蛋白對NtrC的磷酸化能力比NtrB低。 (4)ΔntrC和ΔntrB都開啟一種新聚合物的合成。ΔntrC利用谷氨酸為氮源時所產(chǎn)新聚合物產(chǎn)量最高,達(dá)到6.5 g/L;ΔntrB以KNO_3為氮源時新聚合物產(chǎn)量只有2.6 g/L。ΔntrC和ΔntrB解除了氮源對新胞外聚合物合成的限制作用,在氮源充足條件下,二者都能合成新的胞外聚合物。新聚合物具有極強(qiáng)的吸水性,但不溶于水,也不溶解于NaOH、HCl和無水乙醇。紅外光譜掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn),新聚合物的吸收峰與熱凝膠標(biāo)樣的吸收峰大部分一致。樣品在1000-1100 cm~(-1)和3480 cm~(-1)分別有很強(qiáng)的糖苷鍵和羥基的特征吸收;但是新聚合物不同于熱凝膠是在890 cm~(-1)處沒有明顯的β 構(gòu)型的特征吸收峰。單糖組成分析發(fā)現(xiàn),新聚合物由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和其余一種未知的單糖組成。 (5)通過添加高能化合物為土壤桿菌31749合成熱凝膠提供能量以提高胞外多糖產(chǎn)量。首先確定了土壤桿菌31749染色體基因組上存在多聚磷酸激酶和外切聚磷酸酶,其中多聚磷酸激酶編碼基因ppk序列與Agrobacterium tumefaciens. C58的同源基因有95%的一致性,而外切聚磷酸激酶編碼基因ppx與Rhizobium sp. NGR234染色體上此基因有86%的一致性。利用3種具有不同高能磷酸鍵的低聚磷酸鹽Na_4P_2O_7、Na_5P_3O_(10)和(NaPO_3)_6取代培養(yǎng)基中的KH_2PO_4-K_2HPO_4,將它們作為高能磷酸鍵供體和磷元素營養(yǎng)添加到熱凝膠發(fā)酵體系中。結(jié)果表明:在培養(yǎng)基中分別添加0.024 mol/L的Na_5P_3O_(10)和0.048 mol/L的(NaPO_3)_6,對應(yīng)的熱凝膠產(chǎn)量較對照分別提高了23%和134%,而副產(chǎn)物乙酸較對照分別降低87.5%和77.7%,表明低聚磷酸鹽的添加促進(jìn)了細(xì)胞代謝過程的能量供給,在緩減副產(chǎn)物積累的同時又強(qiáng)化了熱凝膠的合成。當(dāng)除去上述發(fā)酵體系中的CaCO_3,添加上述3種低聚磷酸鹽時,生物量顯著降低,幾乎不合成熱凝膠,發(fā)酵液pH最低降到2.1。當(dāng)同時以CaCO_3和KH_2PO_4-K_2HPO_4作為緩沖物質(zhì),分別添加0.024 mol/L的Na_5P_3O_(10)和0.048 mol/L的(NaPO_3)_6發(fā)酵時,熱凝膠產(chǎn)量變化不顯著。但是,當(dāng)發(fā)酵液不存在CaCO_3,只有KH_2PO_4-K_2HPO_4作為緩沖物質(zhì)時,添加0.024 mol/L和0.048 mol/L的(NaPO_3)_6將使熱凝膠分別達(dá)到18.4 g/L和16.9 g/L,較對照分別提高60.4%和49.4%。
【圖文】：

1.2.4 氮代謝雙組分系統(tǒng) NtrB-NtrC 研究進(jìn)展(1) 對細(xì)菌固氮酶編碼基因和氮源代謝能力的調(diào)控NtrB-NtrC 系統(tǒng)主要作用于氮源代謝的調(diào)控，如對細(xì)菌固氮酶的調(diào)控。細(xì)菌固氮酶編碼基因簇包括 nod、nif 和 fix。固氮酶 Nif 編碼基因 nif 和 Fix 編碼基因 fix 受特異激活蛋白 NifA 的正調(diào)控[ 49 ]。Hill 等研究發(fā)現(xiàn)克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)的 nifL 基因轉(zhuǎn)錄受氮代謝雙組分系統(tǒng) NtrB-NtrC 的調(diào)控，而 nifL 的表達(dá)產(chǎn)物 NifL 蛋白調(diào)控 NifA 對環(huán)境中的氮源和分子氧水平做出應(yīng)答[50, 51]，，表明NtrB-NtrC 系統(tǒng)通過調(diào)控 K. pneumoniae 中 NifA 蛋白的表達(dá)而調(diào)控菌體多種固氮酶的活性。He 等也研究發(fā)現(xiàn)，K. pneumonia 的 ntrC 突變株沒有 NifL 蛋白活性，不能使NifA 激活固氮酶編碼基因 nif 和 fix 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，菌體不能對環(huán)境中氮源的含量及種類變化做出應(yīng)答。其它研究結(jié)果也表明 NtrC 激活了一些基因的轉(zhuǎn)錄，而這些基因的編碼產(chǎn)物在氮源限制條件下激活了 NifL，NifL 進(jìn)一步激活 NifA 而形成一個調(diào)控鏈，使很多固氮酶得以表達(dá)，達(dá)到固氮效果[52]，如圖 1-3 所示。

圖 2-2 土壤桿菌 31749 的 RNA 凝膠電泳圖rophoretogram of RNA from Agrobacterium stracted from sample at 36h; B is the RNA extrRμg)在反轉(zhuǎn)錄前加 2 units 的 DNasd cDNA Synthesis Kit 試劑盒所附程序-qPCR 進(jìn)行分析，以 16S rRNA 作為內(nèi)度大約 20 個堿基，退火溫度為 60℃bp 之間，由賽百盛上海有限公司合成。R Green) QPK-201 (Toyobo, Osaka, Ja個樣本做 3 個平行，相對轉(zhuǎn)錄水平采轉(zhuǎn)錄水平的變化以其在氮源充足時及質(zhì)譜鑒定實驗方法
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：X172

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