【摘要】：水環(huán)境的病原性污染是當今世界上危害最嚴重的問題之一。研究水體病原性污染狀況，分析病原體對人類健康造成的風險具有十分重要的意義。用傳統(tǒng)的微生物指標評價病原體造成的健康風險具有多方面的不確定性，而近年來發(fā)展起來的PCR技術具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點，已在醫(yī)學及相關領域的病原體檢測中體現出其優(yōu)越性。但是目前PCR技術用于水環(huán)境病原體檢測還處于嘗試階段，有效的方法體系尚未建立，以此為基礎的病原體健康風險評價方法還是空白。為此，本論文在國家自然科學基金項目“水環(huán)境中腸道感染性病毒群的PCR綜合鑒定和病原性污染風險評價”的支持下開展研究，建立了高效實用的腸道病原體PCR檢測方法和病原性污染評價指標，在進行水環(huán)境長期監(jiān)測的基礎上研究了腸道病原體在地表水體中的分布和變化規(guī)律，基于腸道病原體PCR檢測的結果對不同水體進行了健康風險評價。 本論文根據我國水傳播疾病和水體病原性污染的特點，選取腸道病毒作為典型的病毒性病原體，，傷寒沙門菌、志賀菌、大腸埃希菌和霍亂弧菌作為典型的腸道病原菌，分別建立了定性和定量的PCR檢測方法。 采用改進的微孔濾膜吸附-洗脫濃縮法進行水體樣品中腸道病毒的濃縮，研究了濾膜的孔徑、材質、洗脫劑的種類、洗脫方式、PEG的濃度對病毒回收率的影響，進行了病毒濃縮方法的優(yōu)化。研究結果表明，0．22μm孔徑的混合纖維素酯微孔濾膜比硝酸纖維素和尼龍膜的實用效果更好；采用3％牛肉膏-0．05mol／L甘氨酸緩沖液作為洗脫劑，使用磁力攪拌方式進行膜洗脫的方法具有效果好，操作方便等優(yōu)點；在洗脫液濃縮步驟中，當PEG的最終濃度為130g／L時，病毒的回收率最高；改進的微孔濾膜吸附-洗脫法的病毒回收效果優(yōu)于滑石粉-硅藻土吸附層吸附-洗脫法、化學絮凝沉淀法和滑石粉-硅藻土絮凝沉淀法等方法，對于不同接種量(38～3800CCID_(50))的病毒回收率均可達到70％以上。 根據腸道病毒RNA5′非編碼區(qū)中保守序列的同源性設計了針對首輪PCR和巢式PCR的兩對腸道病毒通用引物，經GenBank數據庫BLAST比對分析，所設計的通用引物涵蓋了脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、�？刹《�、腸道病毒71型等多種腸道病毒。利用脊髓灰質炎病毒1～3型，柯薩奇病毒B3型作為參考病毒株，建立了腸道病毒巢式RT-PCR檢測方法。結果表明，AMV酶能夠有效完成病毒RNA的逆轉錄，比M-MLV酶更具有適用性；鎂離子濃度2mmol／L，退火溫度55℃是最佳的首輪PCR反應條件；巢式PCR不僅具有良好的特異性，而且靈敏度高達0．038CCID_(50)，適用于低病毒濃度的環(huán)境水樣檢測。在腸道病毒RT-PCR檢測的基礎上，建立了實時熒光定量RT-PCR檢測方法，利用pMD18-T載體構建了重組質粒作為標準品，確定了反應體系中鎂離子的最佳濃度為4．0mmol／L，最佳退火溫度為55℃，讀板溫度為85℃；檢測靈敏度為4．62GEC，且特異性良好，與其他微生物沒有交叉反應；動力學線性范圍廣，在4．62～4．62×10~9GEC的模板量范圍內，模板量的對數值與C_T值之間具有良好的線性關系(R~2=0．997)；精密度高，檢測樣品C_T值批內變異系數低于2％，批間變異系數低于5％。 針對典型腸道病原菌，分別建立了傷寒沙門菌、志賀菌、大腸埃希菌和霍亂弧菌的常規(guī)PCR檢測和實時熒光定量PCR檢測方法。利用標準菌株，建立了典型腸道病原菌的實時熒光定量PCR標準曲線，傷寒沙門菌、志賀菌和大腸埃希菌的檢測靈敏度分別為0．366CFU、0．44CFU和4．56CFU；當模板量分別在0．366CFU～3．66×10~5CFU，0．44CFU～4．4×10~5CFU和4．56CFU～4．56×10~5CFU的范圍內時，模板量的對數值與C_T值之間具有良好的線性關系。 運用本研究建立的PCR檢測方法，對西安市典型地表水體(飲用水源水—黑河)、景觀湖泊—興慶湖和北湖、城市排污河—mP河)中的腸道病原體進行了長期監(jiān)測，并以污水處理廠二級處理出水作為參比，研究了腸道病毒和典型腸道病原菌在水環(huán)境中的分布規(guī)律。長達1年的監(jiān)測結果表明，腸道病毒在各地表水體和二級處理出水中均被檢出，且檢出濃度服從對數正態(tài)分布規(guī)律；黑河、興慶湖、北湖、mP河和二級處理出水中腸道病毒的年平均濃度分別為47GEC／L、127GEC／L、120GEC／L、422GEC／L和746GEC/L；黑河的腸道病毒在春夏兩季陽性率高，濃度也較高；興慶湖和北湖的腸道病毒的高陽性率和高濃度發(fā)生在夏末秋初；mP河的腸道病毒的陽性率和濃度普遍偏高，且濃度變化幅度大；對參比的二級處理出水而言，9月初至12月中旬和4月下旬至5月末是腸道病毒的高濃度期。各水體中腸道病毒的核酸序列具有較強的相似性，表明病毒種類比較單一。 在對傷寒沙門菌、志賀菌、大腸埃希菌和霍亂弧菌進行定量PCR檢測的同時，也運用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法進行了細菌總數、大腸菌群的糞大腸菌群的檢測。結果表明，霍亂弧菌在各地表水體中均呈陰性；其他各類病菌的檢出濃度均服從對數正態(tài)分布規(guī)律；黑河、興慶湖和北湖的傷寒沙門菌PCR檢測結果全部為陰性，而mP河和二級處理出水的傷寒沙門菌濃度較高，但沒有明顯的季節(jié)變化規(guī)律；志賀菌在各種水體中均存在，但夏季之前濃度很低，進入夏季后濃度迅速升高；各水體的大腸埃希菌濃度都呈現從冬季到夏季逐漸升高的趨勢。 腸道病毒、典型腸道病原菌與傳統(tǒng)細菌學和理化指標之間關系的分析結果表明：腸道病毒與細菌指標之間無顯著相關性，在細菌濃度較低的水體中仍可能檢出腸道病毒，細菌學指標難以代替腸道病毒的檢測；水中細菌總數、大腸菌群、糞大腸菌群與水溫、濁度、COD之間呈顯著正相關，與溶解氧呈顯著負相關；傷寒沙門菌的突增通常發(fā)生在大腸菌群、糞大腸菌群濃度超過10~3CFU／100mL時；志賀菌與傳統(tǒng)細菌學指標呈顯著正相關，其陽性率和濃度隨著大腸菌群和糞大腸菌群濃度增大而逐漸上升，在大腸菌群濃度較低的水體中仍有志賀菌出現。 根據腸道病原體的PCR檢測結果，結合暴露途徑和劑量反應關系分析，運用數學模型對不同地表水體中腸道病原體造成的健康風險進行了評價。判定了各水體中的“最大風險腸道病原體”，并提出了相應的風險控制需求。評價結果表明：作為飲用水源的黑河水，腸道病毒是具有最大風險的腸道病原體，以10~(-4)／a作為可接受年風險，在腸道病毒去除率為6-log的條件下，可以保障水質安全性大于90％。作為景觀娛樂水體的興慶湖和北湖，腸道病毒仍是最大風險腸道病原體，當腸道病毒的去除率達到4-log時，水質安全性在90％以上。mP河的腸道病原體風險的主要來源是多方面的，若直接作為景觀用水，則志賀菌和大腸埃希菌造成的健康風險高于腸道病毒，但由于腸道病原菌與腸道病毒分布的差異，當它們的去除率都為4-log時，與腸道病毒相關的水質安全性仍然較低。
【學位授予單位】：西安建筑科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：X824

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 孫樹青;胡國華;王勇澤;李誠;;湘江干流水環(huán)境健康風險評價[J];安全與環(huán)境學報;2006年02期

2 方肇寅,宋燕燕,董虹,王秀云,溫樂英,索玉琴;北京飲用水源病毒污染研究[J];病毒學報;1992年03期

3 方肇寅,宋燕燕,祝學禮,于修平,索玉琴,薛金榮,溫樂英,王秀云,蔡詩文,丘福禧,洪濤;高碑店污水系統(tǒng)病毒污染情況的檢測[J];病毒學報;1986年03期

4 張文清,馬文煜,駱文靜,姜紹諄,胡艷冰,侯悅,張進,于碧云;PEG6000沉淀結合差速離心方法濃縮水中脊髓灰質炎病毒[J];第四軍醫(yī)大學學報;2000年01期

5 李勁,李丕芬,王祖卿,張楚瑜;長江武漢段水中病毒污染的研究[J];環(huán)境科學學報;1987年02期

6 任立新,李國軍,劉萬紅,張波;丹東口岸污水中沙門氏菌檢索[J];中國國境衛(wèi)生檢疫雜志;1994年S3期

7 馬驄;馬學斌;;海水中病毒的檢測與分布研究進展[J];解放軍預防醫(yī)學雜志;2007年02期

8 郭潤霞,黃海云,冀玲,常平,吳聯熙;三氯化鋁-氯化鈉絮凝法濃縮水中腸道病毒[J];環(huán)境與健康雜志;1997年04期

9 仇付國,王曉昌;城市回用污水中病毒對人體健康風險的評價[J];環(huán)境與健康雜志;2003年04期

10 錢家忠,李如忠,汪家權,李昱霞;城市供水水源地水質健康風險評價[J];水利學報;2004年08期

相關博士學位論文 前1條

1 肖慧;渤海灣近岸海域的細菌學研究及其在海岸帶環(huán)境質量評價中的應用[D];中國海洋大學;2005年

本文編號：2660569