發(fā)布時(shí)間：2020-05-08 06:16

【摘要】：構(gòu)樹(Broussonetia papyifera)是具有良好綜合價(jià)值的與重金屬污染修復(fù)有關(guān)的經(jīng)濟(jì)植物,目前有關(guān)構(gòu)樹響應(yīng)重金屬鎘(Cd)脅迫的研究較少。對(duì)湖南湘潭尾礦區(qū)植被調(diào)查發(fā)現(xiàn),構(gòu)樹是其重要的抗性植被資源。本研究對(duì)來源于湘潭尾礦區(qū)的構(gòu)樹資源進(jìn)行優(yōu)選,獲得了在發(fā)芽、生理等相關(guān)方面具有良好表現(xiàn)的優(yōu)株作為研究材料,開展構(gòu)樹抗Cd相關(guān)研究,結(jié)果如下:通過對(duì)構(gòu)樹優(yōu)株進(jìn)行消毒滅菌后獲得其無菌苗,并進(jìn)一步構(gòu)建了構(gòu)樹組培體系。對(duì)構(gòu)樹組培苗在無菌及土壤栽植條件下進(jìn)行不同濃度不同時(shí)間的CdC12脅迫,分析構(gòu)樹響應(yīng)Cd脅迫的生理變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),構(gòu)樹在Cd脅迫下其活性氧(ROS)大量積累、膜脂過氧化加劇、細(xì)胞滲透增強(qiáng)、脯氨酸含量增加、抗氧化酶(SOD、POD、GST等)活性增強(qiáng),表明構(gòu)樹Cd脅迫響應(yīng)生理涉及ROS代謝、抗氧化酶系統(tǒng)反應(yīng)、脯氨酸代謝等重要過程。通過綜合分析不同Cd脅迫濃度和時(shí)間下的生理響應(yīng),可知6月大構(gòu)樹較適合使用500 μM CdC12脅迫120 h來進(jìn)行相關(guān)分析。因此,以0 h為對(duì)照,在此脅迫處理下通過Illumina HiSeq方法測(cè)定了構(gòu)樹根和葉的轉(zhuǎn)錄組,總共獲得180,678,660bp(27.1G)凈讀數(shù)并被組裝成589,487個(gè)高質(zhì)量unigenes,其中256,025和250,251個(gè)分別在GO和PFAM被注釋�？傆�(jì)24,414個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)被GO注釋,且117,547個(gè)KEGG注釋的DEGs被至少歸為47個(gè)KEGG途徑。篩選出與構(gòu)樹Cd響應(yīng)相關(guān)的諸多轉(zhuǎn)錄因子(AUX/IAA、ARF、bHLH、bZIP、GRAS、NAC、MYB、WRKY、AP2/EREBP 等)和蛋白(SOD、POD、V-ATPase、GST、Lea、PPO等)。同時(shí),可知構(gòu)樹Cd脅迫調(diào)控涉及較多信號(hào)通路,如ABA、MAPK、Ca2+、SOS等;且與苯丙素生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和谷胱甘肽代謝等途徑具有重要關(guān)系,這不僅為構(gòu)樹逆境機(jī)制研究提供了一個(gè)較為豐富的基因序列資源,也為研究構(gòu)樹及其鎘應(yīng)答機(jī)制和分子生物學(xué)提供了重要候選基因。同時(shí),這有助于闡明構(gòu)樹的Cd脅迫響應(yīng)分子機(jī)制,并通過培育新的耐逆品種促進(jìn)重金屬污染區(qū)的生物修復(fù)。為進(jìn)一步研究構(gòu)樹Cd脅迫響應(yīng)分子機(jī)制,從構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄組中深入篩選MYB類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析,綜合篩選出38個(gè)具有完整ORF的MYB轉(zhuǎn)錄因子,經(jīng)表達(dá)及BLAST等多重分析,從中獲得18個(gè)R2R3-MYB基因。這18個(gè)基因在不同時(shí)間(0、3、6、12、24、48h)的CdCl2處理下表現(xiàn)出較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,且具有表達(dá)的時(shí)序性和根、莖、葉表達(dá)組織特異性。表明,構(gòu)樹R2R3-MYB在鎘脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)中具有良好的應(yīng)答潛力,具有良好的研究價(jià)值和前景。對(duì)18個(gè)R2R3-MYB基因的表達(dá)水平進(jìn)行聚類,綜合分析發(fā)現(xiàn)BpTT2和BpMYB6具有較高的表達(dá)水平。因此,選擇BpTT2和BpMYB6基因?yàn)榇?對(duì)R2R3-MYB的抗Cd功能進(jìn)行分析。分別構(gòu)建BpTT2和BpMYB6基因的植物過表達(dá)載體,并分別將二者在構(gòu)樹中過量表達(dá),通過與非轉(zhuǎn)化株系(NT)和空載體轉(zhuǎn)化株系(CK)比較,分析BpTT2和BpMYB6基因調(diào)控Cd脅迫響應(yīng)的功能。結(jié)果顯示,BpTT2和BpMYB6基因的過量表達(dá)均能通過調(diào)節(jié)植株在Cd脅迫下的ROS代謝、抗氧化酶活性、多酚物質(zhì)積累、脯氨酸代謝、細(xì)胞穩(wěn)定和膜脂化來改善植株的抗Cd能力。通過分析下游防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因在BpTT2和BpMYB6基因過量表達(dá)株系中的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)BpTT2和BpMYB6基因的高水平表達(dá)能有效提高下游BpSOD1、BpSOD2、BpPOD1、BpPOD47、BpGSTU8、BpGPX-1、BpAPX-1、BpLEA、BpPP1、BpSDH1、BpALDH、BpCHS1、BpFLS、BpDFR1 等基因的轉(zhuǎn)錄。表明,在構(gòu)樹Cd脅迫響應(yīng)調(diào)控中,BpTT2和BpMYB6基因主要通過調(diào)控下游相關(guān)基因來提高植株的抗氧化酶活性、多酚物質(zhì)積累、谷胱甘肽及脯氨酸代謝等以增強(qiáng)植株的ROS清除能力、減緩細(xì)胞膜脂化和細(xì)胞受損程度,進(jìn)而達(dá)到改善抗鎘脅迫的效果。通過分析下游防衛(wèi)反應(yīng)在BpTT2和BpMYB6基因過量表達(dá)株系中的具體轉(zhuǎn)錄水平及相關(guān)的具體生理指標(biāo),可知BpTT2和BpMYB6在調(diào)控構(gòu)樹Cd脅迫響應(yīng)中的具體表現(xiàn)不同。整體上,BpTT2 對(duì)飛游 BpSOD2、BpPOD47、BpGSTU8、BpGPX-1、BpFLS、BpDFRl、BpLea、BpPP1、BpSDH1等基因的調(diào)控水平比BpMYB6基因要強(qiáng)。同時(shí),BpTT2對(duì)下游BpGSTU、BpLea、BpDFR1、BpGPX、BpPP1、BpSDH1等基因的表達(dá)調(diào)控較強(qiáng);而BpMYB6基因?qū)pPOD1、BpSOD1、BpGSTU8、BpGPX、BpAPX-1、BpSOD2 等基因的表達(dá)調(diào)控強(qiáng)于其他基因,這不僅體現(xiàn)了BpTT2和BpMYB6基因在調(diào)控Cd脅迫抗逆性上的差異性,也表明BpTT2調(diào)控Cd響應(yīng)中谷胱甘肽代謝、膜脂穩(wěn)定、多酚類物質(zhì)代謝等途徑更為突出;而BpMYB6基因調(diào)控Cd響應(yīng)與抗氧化系統(tǒng)代謝更相關(guān)。綜上,本研究系統(tǒng)的篩選了尾礦區(qū)構(gòu)樹優(yōu)株并建立組培體系,在此基礎(chǔ)上開展了構(gòu)樹Cd脅迫生理評(píng)價(jià)和轉(zhuǎn)錄組分析,獲得了大量構(gòu)樹Cd響應(yīng)相關(guān)基因資源和代謝途徑,并篩選了其中重要的一類轉(zhuǎn)錄因子MYB,進(jìn)一步對(duì)R2R3-MYB基因的Cd響應(yīng)表達(dá)模式進(jìn)行了分析,從中篩選出具有代表性的BpTT2和BpMYB6基因進(jìn)行抗Cd功能研究。結(jié)果表明BpTT2和BpMYB6基因的過量表達(dá)均能有效改善構(gòu)樹的抗Cd能力,且涉及不完全相同的調(diào)控途徑。這為后續(xù)開展構(gòu)樹Cd及重金屬響應(yīng)分子機(jī)制提供了重要的候選基因資源,也為耐逆品種選育以促進(jìn)重金屬污染區(qū)的生物修復(fù)打下了良好基礎(chǔ)。
【圖文】：

２．３．１構(gòu)樹無菌苗的獲得逡逑對(duì)擬定外植體經(jīng)ＨｇＣｌ２消毒滅菌后接種于ＭＳ培養(yǎng)基中培養(yǎng)，大約３邋ｄ即可逡逑見有嫩芽長出，，待接種外植體２０？３０邋ｄ獲得無菌苗，可用于后續(xù)分化培養(yǎng)（圖２．１邋）。逡逑Ｉ邋ｒ｜邐ｔｒＦ逡逑圖２．１構(gòu)樹無菌苗的獲得。Ａ－Ｅ分別表示接種外植體后３、１０、１５、２０、２５、３０邋ｄ。逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ邋ｓｔｅｒｉｌｅ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ邋ｏｆ邋Ｂ．邋ｐａｐｙｉｆｅｒａ．邋Ａ－Ｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋３，邋１０，邋１５，邋２０，邋２５，邋ａｎｄ邋３０邋ｄ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｌａｎｔｓ．逡逑２．３．２構(gòu)樹組培體系逡逑從構(gòu)樹無菌苗上切�。保浚插澹悖黹L寬的葉片，于１／２ＭＳ分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化逡逑（圖２．２邋Ａ－Ｂ），接種后約７？１０邋ｄ開始出現(xiàn)愈傷組織（圖２．２邋Ｃ－Ｄ），然后經(jīng)過脫逡逑分化處理后長出小芽（大概接種２０邋ｄ）（圖２．２邋Ｅ－Ｆ），切取小芽置Ｔ？生根培養(yǎng)基逡逑１７逡逑

逡逑中培養(yǎng)（圖２．２邋Ｇ）邋４？５周（圖２．２邋Ｈ）可用于后續(xù)開展轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。逡逑Ｉ：邋＇：邋＿逡逑圖２．２構(gòu)樹組培體系建立。Ａ，接種葉片；Ｂ，葉片在分化培養(yǎng)基上３？５邋ｄ；邋Ｃ－Ｄ，分化培養(yǎng)逡逑１２？１６邋ｄ；邋Ｅ－Ｆ，分化２０？２５邋ｄ；邋Ｇ，小芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基；Ｆ，分化生長的植株。逡逑Ｆｉｇ．邋２．２邋Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｏｆ邋Ｂ．邋ｐａｐｙｉｆｅｒａ．邋Ａ，邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｌｅａｖｅｓ；邋Ｂ，邋ｌｅａｖｅｓ邋ｉｎ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｍｅｄｉｕｉｎ邋ｆｏｒ邋３？５邋ｄ；邋Ｃ－Ｄ，邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ邋ｆｏｒ邋１２？１６邋ｄ；邋Ｅ－Ｆ，邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ邋ｆｏｒ邋２０邋？２５邋ｄ；逡逑Ｇ，邋ｓｍａｌｌ邋ｓｈｏｏｔｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ邋ｔｏ邋ｒｏｏｔｉｎｇ邋ｍｅｄｉｕｍ；邋Ｆ，邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｇｒｏｗｎ邋ｐｌａｎｔｓ．逡逑２．３．３構(gòu)樹Ｃｄ脅迫濃度及時(shí)間確定逡逑將生根培養(yǎng)１個(gè)月左右的構(gòu)樹組培苗進(jìn)行０、５０、１００、２００邋ＣｄＣｌ２處理０逡逑（非處理對(duì)照）、〖、３、６、９邋ｄ，觀察植株的存活表型情況，測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率分逡逑析各株系的細(xì)胞受損程度。逡逑６０邋－Ｉ邐逡逑Ｉ邋Ｉ邋０邋ｄ逡逑Ｖ￣７￣ｌ，邋Ｉｄ邐？逡逑５０邋－邋ＫＳ３ｄ邐
【學(xué)位授予單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X503.235;S792.99


本文編號(hào)：2654257