【摘要】：構樹(Broussonetia papyifera)是具有良好綜合價值的與重金屬污染修復有關的經(jīng)濟植物,目前有關構樹響應重金屬鎘(Cd)脅迫的研究較少。對湖南湘潭尾礦區(qū)植被調查發(fā)現(xiàn),構樹是其重要的抗性植被資源。本研究對來源于湘潭尾礦區(qū)的構樹資源進行優(yōu)選,獲得了在發(fā)芽、生理等相關方面具有良好表現(xiàn)的優(yōu)株作為研究材料,開展構樹抗Cd相關研究,結果如下:通過對構樹優(yōu)株進行消毒滅菌后獲得其無菌苗,并進一步構建了構樹組培體系。對構樹組培苗在無菌及土壤栽植條件下進行不同濃度不同時間的CdC12脅迫,分析構樹響應Cd脅迫的生理變化。結果發(fā)現(xiàn),構樹在Cd脅迫下其活性氧(ROS)大量積累、膜脂過氧化加劇、細胞滲透增強、脯氨酸含量增加、抗氧化酶(SOD、POD、GST等)活性增強,表明構樹Cd脅迫響應生理涉及ROS代謝、抗氧化酶系統(tǒng)反應、脯氨酸代謝等重要過程。通過綜合分析不同Cd脅迫濃度和時間下的生理響應,可知6月大構樹較適合使用500 μM CdC12脅迫120 h來進行相關分析。因此,以0 h為對照,在此脅迫處理下通過Illumina HiSeq方法測定了構樹根和葉的轉錄組,總共獲得180,678,660bp(27.1G)凈讀數(shù)并被組裝成589,487個高質量unigenes,其中256,025和250,251個分別在GO和PFAM被注釋�？傆�24,414個差異表達基因(DEGs)被GO注釋,且117,547個KEGG注釋的DEGs被至少歸為47個KEGG途徑。篩選出與構樹Cd響應相關的諸多轉錄因子(AUX/IAA、ARF、bHLH、bZIP、GRAS、NAC、MYB、WRKY、AP2/EREBP 等)和蛋白(SOD、POD、V-ATPase、GST、Lea、PPO等)。同時,可知構樹Cd脅迫調控涉及較多信號通路,如ABA、MAPK、Ca2+、SOS等;且與苯丙素生物合成、植物激素信號轉導和谷胱甘肽代謝等途徑具有重要關系,這不僅為構樹逆境機制研究提供了一個較為豐富的基因序列資源,也為研究構樹及其鎘應答機制和分子生物學提供了重要候選基因。同時,這有助于闡明構樹的Cd脅迫響應分子機制,并通過培育新的耐逆品種促進重金屬污染區(qū)的生物修復。為進一步研究構樹Cd脅迫響應分子機制,從構樹轉錄組中深入篩選MYB類轉錄因子進行分析,綜合篩選出38個具有完整ORF的MYB轉錄因子,經(jīng)表達及BLAST等多重分析,從中獲得18個R2R3-MYB基因。這18個基因在不同時間(0、3、6、12、24、48h)的CdCl2處理下表現(xiàn)出較強的轉錄表達水平,且具有表達的時序性和根、莖、葉表達組織特異性。表明,構樹R2R3-MYB在鎘脅迫響應調節(jié)中具有良好的應答潛力,具有良好的研究價值和前景。對18個R2R3-MYB基因的表達水平進行聚類,綜合分析發(fā)現(xiàn)BpTT2和BpMYB6具有較高的表達水平。因此,選擇BpTT2和BpMYB6基因為代表,對R2R3-MYB的抗Cd功能進行分析。分別構建BpTT2和BpMYB6基因的植物過表達載體,并分別將二者在構樹中過量表達,通過與非轉化株系(NT)和空載體轉化株系(CK)比較,分析BpTT2和BpMYB6基因調控Cd脅迫響應的功能。結果顯示,BpTT2和BpMYB6基因的過量表達均能通過調節(jié)植株在Cd脅迫下的ROS代謝、抗氧化酶活性、多酚物質積累、脯氨酸代謝、細胞穩(wěn)定和膜脂化來改善植株的抗Cd能力。通過分析下游防衛(wèi)反應相關基因在BpTT2和BpMYB6基因過量表達株系中的轉錄水平,發(fā)現(xiàn)BpTT2和BpMYB6基因的高水平表達能有效提高下游BpSOD1、BpSOD2、BpPOD1、BpPOD47、BpGSTU8、BpGPX-1、BpAPX-1、BpLEA、BpPP1、BpSDH1、BpALDH、BpCHS1、BpFLS、BpDFR1 等基因的轉錄。表明,在構樹Cd脅迫響應調控中,BpTT2和BpMYB6基因主要通過調控下游相關基因來提高植株的抗氧化酶活性、多酚物質積累、谷胱甘肽及脯氨酸代謝等以增強植株的ROS清除能力、減緩細胞膜脂化和細胞受損程度,進而達到改善抗鎘脅迫的效果。通過分析下游防衛(wèi)反應在BpTT2和BpMYB6基因過量表達株系中的具體轉錄水平及相關的具體生理指標,可知BpTT2和BpMYB6在調控構樹Cd脅迫響應中的具體表現(xiàn)不同。整體上,BpTT2 對飛游 BpSOD2、BpPOD47、BpGSTU8、BpGPX-1、BpFLS、BpDFRl、BpLea、BpPP1、BpSDH1等基因的調控水平比BpMYB6基因要強。同時,BpTT2對下游BpGSTU、BpLea、BpDFR1、BpGPX、BpPP1、BpSDH1等基因的表達調控較強;而BpMYB6基因對BpPOD1、BpSOD1、BpGSTU8、BpGPX、BpAPX-1、BpSOD2 等基因的表達調控強于其他基因,這不僅體現(xiàn)了BpTT2和BpMYB6基因在調控Cd脅迫抗逆性上的差異性,也表明BpTT2調控Cd響應中谷胱甘肽代謝、膜脂穩(wěn)定、多酚類物質代謝等途徑更為突出;而BpMYB6基因調控Cd響應與抗氧化系統(tǒng)代謝更相關。綜上,本研究系統(tǒng)的篩選了尾礦區(qū)構樹優(yōu)株并建立組培體系,在此基礎上開展了構樹Cd脅迫生理評價和轉錄組分析,獲得了大量構樹Cd響應相關基因資源和代謝途徑,并篩選了其中重要的一類轉錄因子MYB,進一步對R2R3-MYB基因的Cd響應表達模式進行了分析,從中篩選出具有代表性的BpTT2和BpMYB6基因進行抗Cd功能研究。結果表明BpTT2和BpMYB6基因的過量表達均能有效改善構樹的抗Cd能力,且涉及不完全相同的調控途徑。這為后續(xù)開展構樹Cd及重金屬響應分子機制提供了重要的候選基因資源,也為耐逆品種選育以促進重金屬污染區(qū)的生物修復打下了良好基礎。
【圖文】：

２．３．１構樹無菌苗的獲得逡逑對擬定外植體經(jīng)ＨｇＣｌ２消毒滅菌后接種于ＭＳ培養(yǎng)基中培養(yǎng)，大約３邋ｄ即可逡逑見有嫩芽長出，，待接種外植體２０？３０邋ｄ獲得無菌苗，可用于后續(xù)分化培養(yǎng)（圖２．１邋）。逡逑Ｉ邋ｒ｜邐ｔｒＦ逡逑圖２．１構樹無菌苗的獲得。Ａ－Ｅ分別表示接種外植體后３、１０、１５、２０、２５、３０邋ｄ。逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ邋ｓｔｅｒｉｌｅ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ邋ｏｆ邋Ｂ．邋ｐａｐｙｉｆｅｒａ．邋Ａ－Ｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋３，邋１０，邋１５，邋２０，邋２５，邋ａｎｄ邋３０邋ｄ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｌａｎｔｓ．逡逑２．３．２構樹組培體系逡逑從構樹無菌苗上切取１？２邋ｃｍ長寬的葉片，于１／２ＭＳ分化培養(yǎng)基上進行分化逡逑（圖２．２邋Ａ－Ｂ），接種后約７？１０邋ｄ開始出現(xiàn)愈傷組織（圖２．２邋Ｃ－Ｄ），然后經(jīng)過脫逡逑分化處理后長出小芽（大概接種２０邋ｄ）（圖２．２邋Ｅ－Ｆ），切取小芽置Ｔ？生根培養(yǎng)基逡逑１７逡逑

逡逑中培養(yǎng)（圖２．２邋Ｇ）邋４？５周（圖２．２邋Ｈ）可用于后續(xù)開展轉化等試驗。逡逑Ｉ：邋＇：邋＿逡逑圖２．２構樹組培體系建立。Ａ，接種葉片；Ｂ，葉片在分化培養(yǎng)基上３？５邋ｄ；邋Ｃ－Ｄ，分化培養(yǎng)逡逑１２？１６邋ｄ；邋Ｅ－Ｆ，分化２０？２５邋ｄ；邋Ｇ，小芽轉移至生根培養(yǎng)基；Ｆ，分化生長的植株。逡逑Ｆｉｇ．邋２．２邋Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｏｆ邋Ｂ．邋ｐａｐｙｉｆｅｒａ．邋Ａ，邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｌｅａｖｅｓ；邋Ｂ，邋ｌｅａｖｅｓ邋ｉｎ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｍｅｄｉｕｉｎ邋ｆｏｒ邋３？５邋ｄ；邋Ｃ－Ｄ，邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ邋ｆｏｒ邋１２？１６邋ｄ；邋Ｅ－Ｆ，邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ邋ｆｏｒ邋２０邋？２５邋ｄ；逡逑Ｇ，邋ｓｍａｌｌ邋ｓｈｏｏｔｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ邋ｔｏ邋ｒｏｏｔｉｎｇ邋ｍｅｄｉｕｍ；邋Ｆ，邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｇｒｏｗｎ邋ｐｌａｎｔｓ．逡逑２．３．３構樹Ｃｄ脅迫濃度及時間確定逡逑將生根培養(yǎng)１個月左右的構樹組培苗進行０、５０、１００、２００邋ＣｄＣｌ２處理０逡逑（非處理對照）、〖、３、６、９邋ｄ，觀察植株的存活表型情況，測定相對電導率分逡逑析各株系的細胞受損程度。逡逑６０邋－Ｉ邐逡逑Ｉ邋Ｉ邋０邋ｄ逡逑Ｖ￣７￣ｌ，邋Ｉｄ邐？逡逑５０邋－邋ＫＳ３ｄ邐
【學位授予單位】：中南林業(yè)科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X503.235;S792.99


本文編號：2654257