【摘要】：多環(huán)芳烴(PAHs)是持久性有機(jī)污染物(POPs)的一種,分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的碳?xì)浠衔?多數(shù)具有“三致”效應(yīng),即致癌性、致畸性和致突變性,可通過(guò)生物累積及食物鏈傳遞給海洋生物,給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來(lái)極大危害,目前己引起各國(guó)環(huán)境科學(xué)家的極大重視。2011年歐盟委員會(huì)發(fā)布Regulation (EC) No835/2011法規(guī)提出以苯并(a)芘(BaP)、苯并(a)蒽(BaA)、苯并(p)熒蒽(BbF)和(?)(Chr)4種多環(huán)芳烴總含量作為食品中PAHs限量的新評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本論文選擇我國(guó)沿海重要經(jīng)濟(jì)貝類菲律賓蛤仔(Rudi tapes philippinarum)為研究對(duì)象,利用數(shù)字基因表達(dá)譜和基因克隆表達(dá)分析研究了菲律賓蛤仔在PAHs脅迫下解毒代謝的分子機(jī)制：研究了PAHs對(duì)菲律賓蛤仔不同組織累積含量、解毒代謝酶和相關(guān)基因以及損傷效應(yīng)的影響,初步探討了PAHs在菲律賓蛤仔體內(nèi)蓄積規(guī)律和毒性效應(yīng),篩選基于菲律賓蛤仔的用于海洋PAHs污染評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物；并且通過(guò)對(duì)膠州灣、萊州灣近海養(yǎng)殖水環(huán)境PAHs的含量分析以及基于菲律賓蛤仔的雙殼貝類PAHs生物監(jiān)測(cè)分析,驗(yàn)證了生物標(biāo)志物的有效性,也為評(píng)價(jià)PAHs對(duì)海洋生物毒性效應(yīng)、保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全和監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境PAHs污染提供理論基礎(chǔ)。1菲律賓蛤仔在PAHs脅迫下解毒代謝分子機(jī)制的研究本章首先利用數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)技術(shù)分析了BaP (1 μg/L)脅迫15天時(shí)菲律賓蛤仔消化盲囊組織差異基因表達(dá)情況,對(duì)照組和染毒組分別獲得了10508312和11414297條clean reads,將clean reads上傳至NCBI SRA文庫(kù)(accession number: SRP034889);將clean reads與本實(shí)驗(yàn)室已完成拼接的菲律賓蛤仔轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)unigene進(jìn)行拼接比對(duì),比對(duì)率分別為53.27%和52.22%；通過(guò)DGE序列比對(duì)分析,共篩得差異表達(dá)基因145條,其中上調(diào)基因58條,下調(diào)基因87條；經(jīng)GO功能聚類分析以及KEGG通路分析顯示,差異基因主要涉及機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、抗氧化代謝、細(xì)胞凋亡以及解毒代謝機(jī)制；運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)，選取5條差異表達(dá)關(guān)鍵基因(熱激蛋白22、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、Mantle gene 6、皮連蛋白3、假定蛋白)以及8條非差異表達(dá)解毒代謝關(guān)鍵基因(芳烴受體、熱激蛋白90、熱激蛋白70、環(huán)氧化物水解酶、二氫二醇脫氫酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶)驗(yàn)證了DGE結(jié)果可靠性。通過(guò)RACE和RT-PCR技術(shù)獲得菲律賓蛤仔熱激蛋白70(HSP70)、熱激蛋白90(HSP90)基因的cDNA全長(zhǎng)序列,其中HSP70全長(zhǎng)2336 bp(GenBank Accession Number: KJ569079), HSP90全長(zhǎng)2839 bp (GenBank Accession Number:KJ569080);序列分析表明HSP70基因含有51 bp的5’端非編碼區(qū)、335 bp的3’端非編碼區(qū)和1950 bp的開(kāi)放閱讀框,開(kāi)放閱讀框編碼650個(gè)氨基酸；HSP90基因含有107 bp的5’端非編碼區(qū)、554 bp的3’端非編碼區(qū)和2178 bp的開(kāi)放閱讀框,開(kāi)放閱讀框編碼726個(gè)氨基酸；同源性分析顯示2種基因的蛋白序列與其它雙殼貝類的HSP具有較高的同源性；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),兩者均與其它雙殼貝類親緣關(guān)系最近,與蝦蟹等節(jié)肢動(dòng)物次之,而與硬骨魚(yú)類和高等脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；組織特異性分析發(fā)現(xiàn)HSP70與HSP90在菲律賓蛤仔消化盲囊、鰓、閉殼肌和外套膜中均有表達(dá),兩者均在消化盲囊和鰓中表達(dá)量較高；并且通過(guò)qRT-PCR技術(shù)初步研究了HSP70和HSP90在菲律賓蛤仔PAHs解毒代謝中的功能。2菲律賓蛤仔在PAHs脅迫下生物標(biāo)志物篩選技術(shù)的研究本章以菲律賓蛤仔為研究對(duì)象,將其暴露于PAHs(混合比例BaP:BbF:Chr:BaA=1:1：1：1；染毒梯度：0、0.05、0.5、5 μg/L) 21d,分別于0、1、3、6、10、15、21d取樣,之后停止染毒,進(jìn)行PAHs消除實(shí)驗(yàn),分別于22、24、27、31、36d取樣,取樣組織為鰓、消化盲囊、閉殼肌。測(cè)定了PAHs在4種組織中的累積含量,研究了PAHs在菲律賓蛤仔體內(nèi)的蓄積特征與消除規(guī)律,結(jié)果表明,各處理組不同組織中PAHs的累積含量在染毒實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)呈逐漸升高趨勢(shì),呈現(xiàn)時(shí)間-劑量效應(yīng),在同一染毒濃度下,相同組織中4種PAHs累積含量的順序基本為ChrBaABaPBbF;不同組織中PAHs蓄積含量的順序基本為消化盲囊鰓軟體部閉殼肌。消除實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后,PAHs的累積含量顯著下降,基本在31d趨于穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后中、高濃度PAHs處理組中PAHs累積含量仍然顯著高于對(duì)照組。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)照組無(wú)顯著變化。為了研究PAHs在菲律賓蛤仔體內(nèi)的毒性效應(yīng),取染毒和消除實(shí)驗(yàn)中的鰓和消化盲囊組織,測(cè)定了以下幾種解毒代謝酶及相關(guān)基因(i)Ⅰ相解毒代謝酶(AHH、DD、EH)和Ⅱ相解毒代謝酶(GST、UGT、SULT); (ⅱ)抗氧化防御酶相關(guān)指標(biāo)(總抗氧化能力、SOD、GSH/GSSG); (ⅲ)生物大分子損傷(DNA鏈斷裂、蛋白羰基化、脂質(zhì)過(guò)氧化)解毒代謝關(guān)鍵基因表達(dá)(PgP、AhR、HSP90、ARNT、EH、DD、GST、SULT、SOD)。結(jié)果表明,不同濃度處理組鰓和消化盲囊組織中所有指標(biāo)均被不同程度誘導(dǎo),都具有明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng),其中消化盲囊組織比鰓變化明顯。依據(jù)PAHs累積含量與不同指標(biāo)之間的相關(guān)性分析,選取相應(yīng)的指標(biāo)作為評(píng)價(jià)海洋PAHs污染的生物標(biāo)志物。3基于菲律賓蛤仔的膠州灣、萊州灣PAHs生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的研究膠州灣(紅島、營(yíng)海)、萊州灣(廣利港、下?tīng)I(yíng)港)近海不同季度現(xiàn)場(chǎng)取樣(3月、6月、9月、12月)結(jié)果表明,膠州灣營(yíng)海站點(diǎn)的表層海水與沉積物中PAHs污染較嚴(yán)重,而萊州灣廣利港的PAHs虧染情況要比下?tīng)I(yíng)港嚴(yán)重；各站點(diǎn)中6月和9月的PAHs污染情況較嚴(yán)重；菲律賓蛤仔消化盲囊中AH、GST和SOD酶活力、DNA堿解旋、HSP90、DD和GST的mRNA基因表達(dá)與PAHs含量具有較好的一致性,為篩選膠州灣、萊州灣PAHs污染監(jiān)測(cè)的有效生物標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：X835

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本文編號(hào)：2653932