【摘要】： 全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate, PFOS)是全氟類化合物家族中代表性物質(zhì)之一,被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活領(lǐng)域。PFOS具有難降解性、遠(yuǎn)距離遷移性以及易在生物體體內(nèi)富集并沿食物鏈傳播的特性,對(duì)生物體和環(huán)境具有潛在的危害。在2009年5月,PFOS被正式列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》 腦海馬是生物體進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶的重要組織器官,也是很多外源性化合物影響神經(jīng)系統(tǒng)功能,產(chǎn)生毒性作用的靶器官之一。鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,是參與神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一,主要參與神經(jīng)細(xì)胞突觸傳遞、遞質(zhì)釋放、細(xì)胞構(gòu)筑和生長(zhǎng)、酶系統(tǒng)的激活和突觸可塑性改變等過(guò)程,其與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系已引起廣泛的重視。外源性化合物主要通過(guò)對(duì)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)分子的調(diào)節(jié),對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響。PFOS的神經(jīng)毒性及其機(jī)理研究,是揭示PFOS對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的潛在危害,對(duì)此類化合物進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。 本論文以鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為研究對(duì)象,闡明：①亞慢性PFOS染毒對(duì)大鼠海馬組織的毒性作用；②胚胎期染毒PFOS與出生后染毒PFOS,對(duì)仔鼠海馬組織的毒性影響及差別,并探討其機(jī)制；③PFOS誘導(dǎo)海馬細(xì)胞內(nèi)源性鈣庫(kù)釋放的機(jī)制。為此,本文以大鼠海馬組織和原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元為試驗(yàn)材料,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR Western Blot等生化技術(shù),研究了活體和離體水平上的PFOS染毒,對(duì)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果包括, (1)建立亞慢性PFOS染毒模型,通過(guò)飲水染毒,形成1.7、5.0和15.0 mg／L三個(gè)實(shí)驗(yàn)組,從鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,揭示PFOS對(duì)大鼠腦組織產(chǎn)生毒性作用的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,可以在大鼠大腦皮質(zhì)中檢測(cè)到一定濃度水平的PFOS,其濃度水平隨著染毒劑量的升高而升高；PFOS染毒可以顯著上調(diào)大鼠腦海馬和大腦皮質(zhì)中,鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要信號(hào)分子,鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡα, CaMKⅡα)和環(huán)腺苷酸環(huán)化酶反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)的蛋白表達(dá)量；通過(guò)對(duì)其下游信號(hào)分子的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),PFOS持續(xù)誘導(dǎo)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子-即早基因表達(dá)上調(diào)。結(jié)果提示,PFOS通過(guò)上調(diào)大鼠皮質(zhì)和海馬組織中鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要信號(hào)分子的表達(dá),可能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響。 (2)通過(guò)胚胎期以及出生后仔鼠染毒PFOS的方式,形成仔鼠胚胎期和出生后均不染毒(對(duì)照組)及胚胎期染毒、出生后染毒、胚胎期和出生后均染毒三種仔鼠染毒PFOS的方式,考察PFOS染毒方式對(duì)仔鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響,并揭示PFOS的神經(jīng)毒性機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),可以在仔鼠腦海馬組織中檢測(cè)到一定濃度水平的PFOS;胚胎期染毒及出生后繼續(xù)通過(guò)母乳染毒PFOS的仔鼠海馬組織中PFOS的濃度要顯著高于出生后染毒PFOS的仔鼠海馬組織中PFOS的濃度；同時(shí),這兩種方式染毒PFOS的仔鼠海馬組織中鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要信號(hào)分子,N-甲基-D-天門冬氨酸受體亞型(N-methyl-d-aspartate receptor subtype-2B, NR2B)和鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)的表達(dá),隨著仔鼠年齡的增長(zhǎng),均先升高后降低；CaMKⅡ, CREB的表達(dá)在腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期均上調(diào),而隨著年齡的增長(zhǎng),均不發(fā)生顯著變化；以上結(jié)果提示,不同方式的PFOS染毒,可以影響鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重要功能性信號(hào)分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。結(jié)果表明,PFOS染毒可以對(duì)仔鼠神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生影響；PFOS對(duì)海馬組織中NR2B及下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)分子的調(diào)控表明,PFOS通過(guò)對(duì)谷氨酸受體亞型NR2B表達(dá)的異常誘導(dǎo),對(duì)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生影響,是PFOS產(chǎn)生發(fā)育神經(jīng)毒性的機(jī)制之一。 (3)利用原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元,應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù),探討PFOS染毒誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元內(nèi)源性鈣庫(kù)的具體機(jī)制,同時(shí)對(duì)全氟化合物的另一種代表性物質(zhì),全氟辛酸(perfluorooctanoate, PFOA)對(duì)內(nèi)源性鈣庫(kù)調(diào)節(jié)的機(jī)制也進(jìn)行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn),可以在海馬神經(jīng)元內(nèi)檢測(cè)到一定濃度水平的PFOS和PFOA,其濃度水平受到細(xì)胞外鈣離子的影響,而且PFOS的濃度水平明顯高于PFOA;在細(xì)胞無(wú)外源性鈣離子時(shí),PFOS和PFOA均可以顯著誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度升高,結(jié)果提示PFOS和PFOA可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)源性鈣庫(kù)對(duì)海馬神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子進(jìn)行調(diào)節(jié)；分別使用鈣庫(kù)通道特異性抑制劑2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB)和dantrolene(Dan)后,在進(jìn)行PFOS染毒的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯低于PFOS單獨(dú)染毒組,但是顯著高于對(duì)照組(p0.01)；雖然在加入抑制劑后,再進(jìn)行PFOA染毒的海馬神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度并沒(méi)有顯著高于對(duì)照組(p0.05),但是顯著低于PFOA單獨(dú)染毒組(p0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三磷酸肌醇受體(Inositol(1,4, 5)-trisphosphate receptors, IP3Rs)和蘭嘧啶堿受體(ryanodine receptors, RyRs)通道,是PFOS和PFOA誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元內(nèi)源性鈣庫(kù),向細(xì)胞質(zhì)中釋放鈣離子的機(jī)制之一。 綜上研究結(jié)果得出,PFOS通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞膜上谷氨酸受體亞型NR2B開放,引發(fā)海馬細(xì)胞外源性鈣離子內(nèi)流,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性鈣庫(kù)上IP3Rs和RyRs通道開放,向細(xì)胞質(zhì)中釋放鈣離子,導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度升高,對(duì)其下游信號(hào)分子CaM, CaMKⅡ, CREB,以及c-fos和c-jun的表達(dá)異常調(diào)節(jié),從而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：X174

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