【摘要】：有機(jī)磷阻燃劑是大量生產(chǎn)和使用的一類化學(xué)物質(zhì),主要作為溴代阻燃劑的替代品,在環(huán)境中廣泛存在,屬于新興有機(jī)污染物。目前研究表明:磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(Phosphoric acid tris(1,3-dichloro-2-propyl),TDCIPP)具有致癌性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、生長發(fā)育毒性等毒性效應(yīng),但其對(duì)人神經(jīng)母瘤細(xì)胞毒性效應(yīng)的研究卻鮮見報(bào)道,尤其是TDCIPP誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的分子機(jī)理尚未深入開展。本論文采用體外染毒培養(yǎng)方式,深入探討了 TDCIPP對(duì)人神經(jīng)母瘤細(xì)胞(SH-SY5Y cell)的毒性作用及分子機(jī)制。本論文研究工作及主要研究結(jié)果包含以下幾個(gè)方面:1.研究了 TDCIPP暴露對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明TDCIPP暴露于SH-SY5Y細(xì)胞的最大無效應(yīng)濃度為2.5 μM,最低效應(yīng)濃度為10 μM;TDCIPP在10-200 μM的濃度范圍內(nèi)顯著降低細(xì)胞生存率且具有劑量和時(shí)間依賴性,TDCIPP作用24 h,SH-SY5Y細(xì)胞的半數(shù)致死劑量為100 μM。同時(shí),TDCIPP誘導(dǎo)SH-SY5Y的細(xì)胞毒性也具有顯著的時(shí)間依賴性,在TDCIPP(100 μM)處理24 h時(shí),細(xì)胞生存率約為50%。2.研究了 TDCIPP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。通過Hochect 33342染色發(fā)現(xiàn)TDCIPP導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生變化,主要表現(xiàn)為核固縮和核破碎,用AnneixV FITC/PI雙染進(jìn)行細(xì)胞凋亡率測(cè)定發(fā)現(xiàn)TDCIPP暴露顯著誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡,且呈顯著劑量依賴性;采用免疫印跡(Westernblot,WB)方法對(duì)凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵蛋白caspase 3/cleaved caspase 3進(jìn)行定量檢測(cè),結(jié)果表明:TDCIPP顯著增加SH-SY5Y細(xì)胞中caspase 3/cleaved caspase 3蛋白的表達(dá)并呈劑量依賴性。3.研究了 TDCIPP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自吞噬及其相關(guān)分子機(jī)制,并揭示了自吞噬在TDCIPP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):TDCIPP能誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自吞噬增強(qiáng),主要表現(xiàn)在經(jīng)TDCIPP處理后,SH-SY5Y細(xì)胞中自吞噬標(biāo)志性蛋白一一微管相關(guān)蛋白輕鏈311(microtubule associated protein light chain 3)/LC3I的比值增加及p62/SQSTM1的降解增加;激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn):細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量顯著增加。自吞噬抑制劑一一3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)和氯喹(Chloroquine,CQ)通過抑制細(xì)胞內(nèi)自吞噬的強(qiáng)度,顯著增強(qiáng)TDCIPP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡,而自吞噬誘導(dǎo)劑一一雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)則通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)自吞噬導(dǎo)致TDCIPP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率顯著降低,細(xì)胞存活率顯著增加。以上結(jié)果表明:自吞噬在TDCIPP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中具有一定的保護(hù)作用。對(duì)TDCIPP誘導(dǎo)自吞噬信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn):活性氧(Reactive oxygen species,ROS)及腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase,AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Manmal target of rapamacy,mTOR)/Unc-51 激酶(Unc-51 kinase,ULK1)信號(hào)通路參與調(diào)解TDCIPP誘導(dǎo)的自吞噬,抗氧化劑vV-乙酰半胱氨酸(iV-acetylcysteine,NAC)能夠有效拮抗TDCIPP誘導(dǎo)AMPK激活并增強(qiáng)自吞噬,并有效抑制TDCIPP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。4.深入探討了 TDCIPP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):TDCIPP引起細(xì)胞內(nèi)ROS及鈣離子含量增加,線粒體膜電位降低。另外,TDCIPP導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)相關(guān)蛋白:真核轉(zhuǎn)錄起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 2A,EIF2a),轉(zhuǎn)錄激活因子 4(Activating transcription factor,ATF4),葡萄糖調(diào)解蛋白(Gucose regulated protein,GRP78)及促凋亡因子 C/EBP 同源蛋白(proapoptotic factor C/EBP homologous protein,CHOP)白的表達(dá)量顯著增加。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑苯基丁酸(phenyl butyric acid,PBA)能夠顯著抑制TDCIPP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急,并引起抑細(xì)胞凋亡基因bcl-2表達(dá)上調(diào),促細(xì)胞凋亡基因bax表達(dá)下調(diào),顯著抑制TDCIPP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。抗氧化劑NAC有效清除細(xì)胞內(nèi)ROS并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致TDCIPP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率降低。因此,TDCIPP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡通過ROS依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體途徑調(diào)節(jié)。5.研究了低劑量TDCIPP對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞分化的作用,并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行深入探討。結(jié)果表明:TDCIPP(0-2.5 μM)處理SH-SY5Y細(xì)胞5 d不會(huì)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生存率產(chǎn)生顯著影響。另外,TDCIPP(2.5 μM)能有效誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化并具時(shí)間依賴性,主要表現(xiàn)為SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)突增長及含長軸突神經(jīng)元比例增多。對(duì)TDCIPP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化作用的研究發(fā)現(xiàn):自吞噬參與調(diào)節(jié)低劑量TDCIPP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞分化,自吞噬抑制劑3MA通過抑制自吞噬顯著減少含有長軸突神經(jīng)元的數(shù)量,同時(shí)也顯著縮短了分化神經(jīng)元表面軸突的長度。細(xì)胞骨架蛋白:神經(jīng)絲蛋白H(neurofilament-H,NF-H),NF-L及β-微管蛋白(β-tubullin)在TDCIPP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化過程中表達(dá)量顯著上β調(diào),自吞噬抑制劑3MA顯著抑制TDCIPP誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)上調(diào)。以上研究結(jié)果表明,低劑量TDCIPP能有效誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化,其分子機(jī)制與自吞噬調(diào)節(jié)的細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)上調(diào)具顯著相關(guān)性。
【圖文】：

１．１有機(jī)磷阻燃劑的特性逡逑１．１．１有機(jī)磷阻燃劑的理化性質(zhì)逡逑ＯＰＦＲｓ是由磷酸基團(tuán)的氫被取代而形成的一類化合物（圖１－１），結(jié)構(gòu)通式逡逑為（ＲＩＯ）邋（Ｒ２０）邋（Ｒ３０）邋Ｐ０。典型ＯＰＦＲｓ可分為三類，，分別是氯代類、烷逡逑基類和芳基類。磷酸酯化過程中醇類物質(zhì)的性質(zhì)決定了邋ＯＰＦＲｓ的物理化學(xué)性質(zhì)。逡逑因此，不同ＯＰＦＲｓ的ＬｏｇＫｏｗ、水溶性等物理化學(xué)性質(zhì)均存在很大差異性，表逡逑１－１列出了常見有機(jī)磷酸酯類阻燃劑和增塑劑的理化性質(zhì)（李富華，２０１１）。逡逑０邋＾逡逑0邋ＩＩ邋0逡逑Ｒｉ邋ｐ邋Ｒ２逡逑ｉ逡逑０邋Ｄ逡逑Ｒ３逡逑圖１－１有機(jī)磷酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＯＰＥｓ逡逑（１）

逡逑現(xiàn)濃度依賴性（圖２－２）。通過計(jì)算得出ＴＤＣＩＰＰ相對(duì)于ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞的半數(shù)致逡逑死量（ＬＣ５0）約為１００邋ｐＭ。ＬＤＨ漏出實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明隨著ＴＤＣＩＰＰ處理組濃度的逡逑增加，對(duì)ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞的毒性作用逐漸增加（圖２－３），在ＴＤＣＩＰＰ邋（１００ｐＭ）逡逑處理不同的時(shí)間發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的增長，ＴＤＣＩＰＰ對(duì)ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞的毒性作逡逑用增加（圖２－４）。由此得出，ＴＤＣＩＰＰ對(duì)ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞的細(xì)胞毒性呈顯著的逡逑濃度和時(shí)間依賴性，此結(jié)果與ＭＴＴ實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。通過上述實(shí)驗(yàn)得出：相對(duì)于逡逑空白對(duì)照，當(dāng)細(xì)胞毒性達(dá)到５０％時(shí)，ＴＤＣＩＰＰ濃度為１００邋ｐＭ，處理時(shí)間為２４邋ｈ。逡逑以上結(jié)果表明，對(duì)于ＴＤＣＩＰＰ對(duì)于ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性作用。逡逑ＩＷＭ逡逑圖２－１．不同濃度ＴＤＣＩＰＰ作用下ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞密度的變化（２４邋ｈ）逡逑Ｆｉｇ邋２－１．邋Ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｄｅｎｓｉｔｙ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｖａｒｉｏｕｓ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＴＤＣＩＰＰ邋（０邋？２００邋ｊｉＭ）邋ｆｏｒ邋２４邋ｈ逡逑？邋１２０－，逡逑？邐器凝茲邐＊＊逡逑Ｕ邐９０－邐Ｕｐ邐ｒ＾Ｆｐｉ逡逑＾邐Ｓ

本文編號(hào)：2648535