【摘要】：20世紀(jì)以來,國內(nèi)外不斷發(fā)生嚴(yán)重的土壤重金屬污染事件,不僅造成了人體健康的嚴(yán)重傷害和巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也給生態(tài)環(huán)境帶來了嚴(yán)重的破壞。針對土壤重金屬對人體和動植物危害的長期性、隱蔽性、不可逆性及循環(huán)過程中難以被降解的特點,人們先后發(fā)明了物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)等技術(shù)。生物修復(fù)技術(shù)利用植物、微生物等對重金屬的生物富集作用修復(fù)受污染的土壤。生物修復(fù)尤其是基于超富集植物的植物修復(fù)技術(shù),由于具有原位修復(fù)、不破壞場地結(jié)構(gòu)、費用低廉以及適合大規(guī)模工程應(yīng)用等優(yōu)勢,一經(jīng)提出就被國際上列入最有前途的重金屬污染土壤治理技術(shù),引起了研究人員的極大興趣。然而,由于已發(fā)現(xiàn)的超富集植物存在生長量較小或重金屬富集能力有限等不足,植物修復(fù)的效率仍然有待進(jìn)一步提高。除了尋找和篩選生物量大、重金屬富集能力強(qiáng)的野生植物資源外,個有效的途徑是通過向土壤中添加化學(xué)強(qiáng)化劑、微生物菌劑或肥料,增強(qiáng)植物對重金屬的富集、提取,其中以添加微生物的環(huán)境風(fēng)險和經(jīng)濟(jì)成本較小。因此,植物—微生物聯(lián)合修復(fù)已經(jīng)成為重金屬污染修復(fù)技術(shù)研究的重點。Cu是生命必需的營養(yǎng)元素,但過量的Cu會對人體和動植物產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。在我國重金屬污染嚴(yán)重的土壤中,Cu是重要的污染元素之一,由于多種原因,大多數(shù)未得到有效的治理。篩選Cu耐性植物和微生物資源,研究植物-微生物聯(lián)合修復(fù)Cu污染土壤的修復(fù)技術(shù),對于豐富生物修復(fù)理論,加強(qiáng)生態(tài)環(huán)境建設(shè)具有重要的理論和實踐意義。本文以湖北大冶銅綠山銅鐵礦廢棄地土壤及其生長的蓖麻為研究對象,結(jié)合野外調(diào)查、水培、盆栽等培養(yǎng)方法,并借助原子吸收分光光度法、透射電鏡和紅外光譜分析等先進(jìn)技術(shù),探討了蓖麻對土壤Cu的積累特性及其富集機(jī)理；從蓖麻根際土壤中分離、鑒定Cu耐性微生物,并采用原子吸收分光光度法、等溫吸附模型及吸附動力學(xué)、紅外光譜分析和差異蛋白分析等技術(shù),探討了高耐Cu菌株TLSB3-K對Cu的吸附及耐性機(jī)理。在此基礎(chǔ)上,通過盆栽試驗,探討添加TLSB-3菌液對蓖麻修復(fù)Cu污染土壤的強(qiáng)化作用。研究內(nèi)容主要包括：(1)大冶銅綠山野生蓖麻Cu富集特性及其植物修復(fù)潛力研究;(2)Cu在蓖麻根細(xì)胞的分布和化學(xué)形態(tài)研究；(3)Cu脅迫對蓖麻根有機(jī)酸分泌及根際土壤酶活性的影響；(4)蓖麻根際土壤耐Cu微生物的分離鑒定；(5)高耐Cu菌株篩選及其吸附動力學(xué)研究；(6)耐Cu菌株TLSB3-K蛋白質(zhì)差異分析；(7)耐銅菌株TLSB3-K對蓖麻修復(fù)銅污染土壤的增強(qiáng)效果。通過上述研究,取得了如下研究結(jié)論：1、野外調(diào)查結(jié)合分析測試結(jié)果表明,大冶銅綠山礦區(qū)蓖麻根際土壤受Cu、Cd、Pb、Zn和Cr等多種重金屬元素的復(fù)合污染,其中土壤Cu、Cd含量為2075.30 mg/kg和432mg/kg,達(dá)到重度污染等級。土壤Cu為該區(qū)域的特征污染元素。蓖麻體內(nèi)含有Cu、Zn、 Pb、Cd等多種重金屬元素,其中以Cu含量最高,植株平均Cu含量為2019.04 mg/kg (DW,下同),其中地上部Cu含量為761.12 mg/kg,根部平均Cu含量1257.92 mg/kg,根部是蓖麻積累Cu的主要器官。實驗結(jié)果表明,蓖麻不僅能能夠在Cu污染嚴(yán)重的土壤正常生長,而且體內(nèi)能夠富集較多的Cu,表現(xiàn)出較強(qiáng)的Cu耐性,在植物修復(fù)Cu污染土地上具有較大的潛力。實驗同時證實,雖然蓖麻植株Cu含量很高,但其種子并未受到Cu的毒害,蓖麻種皮、胚和胚乳的Cu含量都處在正常水平。2、營養(yǎng)液條件下,蓖麻對Cu也具有較強(qiáng)的耐性。Cu濃度為40 mg/kg時,蓖麻幼苗生長正常,其生長速率和生物量指數(shù)最大：Cu濃度為60 mg/kg時植株Cu含量最大,達(dá)到16570.12 mg/kg,其中根部積累的Cu占植株總量的91.31%�；瘜W(xué)浸提結(jié)果顯示,Cu在蓖麻根細(xì)胞內(nèi)以不同的化學(xué)形態(tài)存在,67.66%的Cu結(jié)合在細(xì)胞壁的可交換酸性極性化合物、極性化合物纖維素、木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)團(tuán)和蛋白質(zhì)、果膠等組分上,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中結(jié)合的Cu相對較少；透射電鏡觀察可見蓖麻根細(xì)胞壁變厚,胞壁上附有大量高密度電子體；紅外光譜分析顯示,Cu主要結(jié)合在根細(xì)胞壁上的酸性極性化合物和纖維素、半纖維素、多糖的羧基、羥基官能團(tuán),以及蛋白質(zhì)氨基官能團(tuán)上。根細(xì)胞壁在蓖麻忍耐和解除Cu毒可能起到重要作用。3、人工配土盆栽試驗表明,蓖麻根分泌物中含有草酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸和酒石酸等有機(jī)酸,其中草酸和蘋果酸的含量占有機(jī)酸總量的71.47%；土壤Cu濃度 300 mg/kg時,促進(jìn)酒石酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的分泌；土壤Cu濃度 300 mg/kg時,對有機(jī)酸分泌起抑制作用。雖然Cu脅迫對草酸分泌起抑制作用,但其絕對含量始終高于其它有機(jī)酸。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,根分泌的草酸、蘋果酸與蓖麻植株Cu含量間達(dá)到極顯著線性正相關(guān)水平,乳酸與植株Cu含量間達(dá)到顯著線性正相關(guān)水平。草酸、蘋果酸和乳酸可能對蓖麻Cu吸收起到促進(jìn)作用。4、人工配土條件下,Cu脅迫對土壤酸性磷酸酶表現(xiàn)為激活作用,并且隨著土壤Cu濃度的增加酶活性逐漸增強(qiáng),土壤Cu濃為900 mg/kg時,酶活性增加了118.63%;Cu脅迫對土壤脲酶、土壤過氧化氫酶和土壤蔗糖酶起抑制作用,抑制強(qiáng)度大小為土壤蔗糖酶土壤土壤脲酶土壤過氧化氫酶,土壤Cu濃度為900 mg/kg時,酶活性分別降低了61.0%、21.62%和19.60%。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,土壤過氧化氫酶和土壤蔗糖酶與植株Cu含量間達(dá)到極顯著線性負(fù)相關(guān),土壤酸性磷酸酶酶與植株Cu含量間達(dá)到極顯著線性正相關(guān)。土壤磷酸酶可能在蓖麻根系吸收和轉(zhuǎn)運Cu的過程中起到重要的促進(jìn)作用。5、從蓖麻根際土壤中分離的微生物菌株中,經(jīng)低Cu脅迫篩選出5株細(xì)菌和5株真菌。對5株細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)比較、革蘭氏染色和16SrDNA序列比對,鑒定為4個屬4個種,分別是寡養(yǎng)單胞菌屬的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S. maltophilia)、芽孢桿菌屬的蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、不動桿菌屬的醋酸鈣不動桿菌(A. calcoaceticus)和假單胞菌屬的惡臭假單胞菌(P.putida);對5株真菌進(jìn)行形態(tài)觀察和18SrDNA-ITS序列測定,鑒定3個屬5個種,分別是青霉屬的馬爾尼菲青霉菌(P. marneffei)、曲霉屬的黑曲霉(A. niger)、黃柄曲霉(A. flavipes)和雜色曲霉(A. versicolor)和鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)。6、對蓖麻根際土壤中分離出的10個菌株進(jìn)行復(fù)篩和Cu馴化培養(yǎng)結(jié)果表明,細(xì)菌菌株TLSB3-K對Cu的耐性最強(qiáng),具有用于Cu污染土壤修復(fù)的潛力。菌株TLSB3-K的最適培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,最佳pH是6.5,最適生長溫度為32-36℃,最佳滲透壓(NaCl%)為1.3%。Cu濃度小于300 mg/L時,對菌體生長影響較小,其生長曲線和最大OD值與對照基本保持一致；Cu濃度為500mg/L時,菌體生長受到一定的抑制,其生長曲線和最大OD值稍低于對照；當(dāng)Cu濃度增加到700 mg/L時,Cu對菌體的抑制作用明顯,生長的延滯期明顯延長,且衰亡期提前。7、菌株TLSB3-K對Cu具有較強(qiáng)的吸附能力,吸附量和去除率受不同初始Cu濃度影響較大。初始Cu濃度在100～400mg/L范圍內(nèi),菌體對Cu的吸附量和去除率隨著Cu濃度的上升而增加,最大吸附量與最高去除率分別為148.32 mg/g和15.54%;初始Cu濃度在大于400 mg/L,菌體對Cu的吸附量和去除率隨著Cu濃度的上升而逐漸下降,Cu濃度為700 mg/L時,吸附量下降到52.08 mg/g,去除率僅為3.22%。分別用Langmuir和Freundlich等溫吸附模型對實驗結(jié)果進(jìn)行擬合,Langmuir方程的相關(guān)系數(shù)為0.9230, Freundlich方程的相關(guān)系數(shù)為0.9874,表明用Freundlich方程模擬菌株TLSB3-K對Cu的吸附過程更為合適。根據(jù)Elovich方程,在Cu濃度400 mg/L條件下進(jìn)行時間吸附動力學(xué)擬合,菌株TLSB3-K對Cu的吸附初期上升迅速,1h后趨于平穩(wěn),4h后逐漸達(dá)到平衡狀態(tài),表明菌株TLSB3-K對Cu的吸附除了細(xì)胞表面吸附外,還包括向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移和積累作用。并且通過FTIR結(jié)果證實,Cu主要結(jié)合在菌體細(xì)胞壁多糖和蛋白質(zhì)的羥基、羧基、酰胺基和磷�；鶊F(tuán)上。8、分別提取菌株TLSB3-K的馴化株和對照未馴化株的總蛋白,進(jìn)行2-DE電泳及凝膠圖譜分析,獲得表達(dá)量有顯著性差異(p0.05)蛋白點52個,主要分布在pH4-9的范圍內(nèi)。與對照組相比,Cu馴化菌株表達(dá)量上調(diào)蛋白點的有9個,下調(diào)蛋白點的有31個,消失的蛋白點有12個。其中,上調(diào)差異點783號的相對豐度增加3.5356倍,表明該蛋白點對應(yīng)的蛋白或多肽具有較強(qiáng)的Cu誘導(dǎo)特性；下調(diào)差異點中,編號413、540、508和653的相對豐度分別減少3.16567、4.64262、5.23367和5.55374倍,表明這些差異點可能對Cu處理較為敏感。取9個上調(diào)蛋白點和20個下調(diào)蛋白點(max1.5)進(jìn)行Maldi-TOF-TOF分析,成功鑒定出17個蛋白點,其中87.5%的上調(diào)蛋白為參與能量代謝、抗氧化和外源性物質(zhì)防御蛋白質(zhì),41%的下調(diào)蛋白為參與蛋白質(zhì)和氨基酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)。因此,菌株TLSB3-K對Cu脅迫存在主動防御過程,主要是通過表達(dá)抗氧化酶(物)和銅抗性蛋白增強(qiáng)對Cu的耐性。9、用采自大冶銅綠山采礦廢棄地的Cu污染進(jìn)行盆栽修復(fù)實驗,研究向盆土中添加耐Cu菌株TLSB3-K對蓖麻修復(fù)Cu污染土壤的增強(qiáng)效果。結(jié)果表明,加菌促進(jìn)蓖麻生物量的增加和葉綠素的生成。加菌莖葉和根的生物量分別比對照增加了22.55%和17.82。葉綠素a占葉綠素總量的70%,是蓖麻的主要光合色素。加菌對蓖麻根抗氧化酶SOD、POD具有明顯的激活作用,作用強(qiáng)度隨著盆栽時間逐漸減弱；加菌對CAT活性的影響表現(xiàn)為前期抑制、后期激活的特點。加菌對蓖麻根系分泌蘋果酸、草酸和酒石酸具有明顯的促進(jìn)作用。蘋果酸的促進(jìn)作用隨著盆栽時間的延長而逐漸增強(qiáng),草酸和酒石酸分泌的促進(jìn)作用表現(xiàn)為前期上升、后期下降的趨勢。加菌對過氧化氫酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性的影響都表現(xiàn)為前期激活、后期抑制的特點；加菌對脲酶起激活作用,但強(qiáng)度逐漸減弱。加菌對蓖麻Cu積累具有明顯的增效作用,加菌后植株Cu含量比對照高出25.70%,顯示出較好的增強(qiáng)效果。
【學(xué)位授予單位】：中國地質(zhì)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：X53

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2645311