【摘要】：隨著環(huán)境科學(xué)的日益發(fā)展,環(huán)境中的微生物對(duì)人類社會(huì)的影響越來越受到重視,尤其是環(huán)境中的致病微生物,容易導(dǎo)致人類疾病和社會(huì)恐慌,因此成為了環(huán)境生物分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前,環(huán)境科學(xué)已經(jīng)與化學(xué)、生物和微流控等多種技術(shù)交叉融合,通過充分發(fā)揮各學(xué)科的技術(shù)優(yōu)勢(shì),極大的促進(jìn)了環(huán)境微生物分析檢測(cè)的發(fā)展。其中,分子生物學(xué)分析具有操作簡(jiǎn)單、靈敏性和特異性高的特點(diǎn)。但是,受到儀器、樣品和試劑的使用及成本的限制,在對(duì)多種樣品進(jìn)行大量分析時(shí),存在著操作繁瑣和成本較高等問題,而且無法滿足現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施分析的需要。因此,亟需一種快速、便攜、高通量的檢測(cè)技術(shù),用于環(huán)境致病微生物的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和分析。本論文通過微流控芯片技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合,以PDMS為材料,構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單廉價(jià)的連續(xù)流動(dòng)式PCR擴(kuò)增芯片,可以對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行快速檢測(cè)。一次擴(kuò)增需要的樣品和PCR試劑消耗量分別約為0.1ul和2ul。與傳統(tǒng)的PCR方法相比,本芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,便于攜帶,可以對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行流動(dòng)式分析,而且操作簡(jiǎn)便,能夠初步滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。在此基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了用于空氣中微生物檢測(cè)的高通量流動(dòng)式PCR芯片。通過閥門的開啟和閉合,對(duì)反應(yīng)液的流動(dòng)進(jìn)行控制,實(shí)現(xiàn)了以連續(xù)流動(dòng)進(jìn)樣的方式一次針對(duì)六種空氣中的微生物的檢測(cè)。從細(xì)菌的富集和裂解到芯片PCR擴(kuò)增完成,耗時(shí)約2小時(shí),一次分析需要的樣品量?jī)H為013ul, PCR反應(yīng)試劑約2.5ul,特別適合對(duì)珍貴或稀少樣品的分析。以大腸桿菌為目標(biāo)菌株,測(cè)得該芯片的最低檢測(cè)限約為118個(gè)細(xì)菌。本研究構(gòu)建的微流控芯片是首個(gè)具有直接針對(duì)空氣中的微生物進(jìn)行分子生物學(xué)分析能力的設(shè)備,在對(duì)環(huán)境氣溶膠中的病原微生物的快速分析中將發(fā)揮重要作用,通過改進(jìn)和完善,有望實(shí)現(xiàn)環(huán)境空氣微生物的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和早期預(yù)警。為了進(jìn)一步滿足高通量檢測(cè)的需要,提高檢測(cè)特異性,我們?cè)诔Ｒ?guī)基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了基于微流控的靜態(tài)核酸雜交芯片。通過設(shè)計(jì)針對(duì)細(xì)菌16SrDNA可變區(qū)的寡核苷酸探針,可以實(shí)現(xiàn)一次對(duì)五種常見環(huán)境致病微生物的快速雜交分析。探針的特異性較好,最低檢測(cè)限與常規(guī)的基因芯片技術(shù)相當(dāng),但試劑消耗和反應(yīng)耗時(shí)分別約為常規(guī)方法的10%和50%。我們通過將連續(xù)流動(dòng)式PCR芯片與核酸雜交芯片進(jìn)行整合,開發(fā)了快速、便攜和成本低廉的微生物核酸分析系統(tǒng)。本研究是環(huán)境科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)研究院的交叉聯(lián)合項(xiàng)目,通過環(huán)境生物學(xué)技術(shù)和微流控技術(shù)的結(jié)合,對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行分析和檢測(cè),為環(huán)境科學(xué)的發(fā)展提供新的技術(shù)支持。另外,本研究所構(gòu)建的微流控芯片系統(tǒng)在對(duì)環(huán)境中其它微生物的檢測(cè)中也能發(fā)揮出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),具有較高的理論和應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：X835

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2640337