【摘要】：砷(Arsenic,As)是一種廣泛存在于自然界中的類金屬,最常見的兩種形態(tài)為亞砷酸鹽[Arsenite,As(III)]和砷酸鹽[Arsenate,As(V)]。砷氧化細菌的砷氧化酶(Aio BA)催化高毒性的As(III)氧化成低毒性的As(V),而aio BA的表達受到三組份調(diào)控系統(tǒng)Aio XSR的調(diào)控,其中AioR為轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。目前發(fā)現(xiàn)一些砷氧化細菌可以利用砷氧化產(chǎn)生的能量促進生長,且具有趨向于As(III)的現(xiàn)象,但As(III)趨化的受體蛋白還未被鑒定,且As(III)趨化的機制尚不清楚。此外,加砷促長的異養(yǎng)砷氧化細菌砷氧化影響的代謝路徑以及AioR是否可以調(diào)控其他代謝路徑也尚不清晰。本研究以一株分離自砷污染的地下水沉積物中的砷氧化型根癌農(nóng)桿菌GW4為研究對象,該細菌具有極高的As(III)抗性,且同時具有加砷促長和趨向于As(III)的表型。我們在細菌GW4基因組中共找到20個甲基趨化受體基因mcp,其中1個mcp位于砷基因島中。該mcp基因及其他趨化基因(che A、che Y2與fli G)受到As(III)的誘導(dǎo),且通過MEME網(wǎng)站在mcp啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了AioR的結(jié)合位點。通過毛細管趨化實驗發(fā)現(xiàn),野生株在0.5 mmol/L 2 mmol/L濃度下具有趨向于As(III)的表型,而缺失mcp或aio R基因后細菌喪失了對As(III)的趨化能力,互補株表型得到了回復(fù),該結(jié)果表明mcp及aio R基因是細菌As(III)趨化必須的。通過色氨酸熒光光譜法發(fā)現(xiàn)Mcp周質(zhì)感應(yīng)區(qū)可以特異性的結(jié)合As(III),但不可以結(jié)合As(V)。以上結(jié)果表明我們鑒定到了首個As(III)趨化受體蛋白。通過lac Z報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)mcp基因在aio R突變株中不再受到As(III)的誘導(dǎo)。通過細菌單雜交實驗和凝膠遷移率實驗(EMSA)證明了AioR可以結(jié)合在mcp基因的啟動子區(qū)從而激活mcp的表達,且通過DNA足跡法最終確定了AioR的精確結(jié)合位點。此外,我們發(fā)現(xiàn)mcp的缺失使細菌GW4加砷促長的現(xiàn)象消失,且砷氧化效率及As(III)抗性均降低。通過以上結(jié)果我們推測,Mcp參與了細菌的砷氧化,AioR同時調(diào)控細菌砷氧化酶Aio BA和As(III)甲基趨化蛋白Mcp的活性,砷氧化和砷趨化可能是相互促進的關(guān)系(圖A)。在發(fā)現(xiàn)AioR可以調(diào)控砷氧化和砷趨化以后,我們聯(lián)想AioR是否還可能調(diào)控其他代謝路徑,因此我們通過i TRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析了以下4組差異蛋白:GW4(+As III)/GW4(-As III)、GW4-?aio R(+As III)/GW4-?aio R(-As III)、GW4-?aio R(-As III)/GW4(-As III)和GW4-?aio R(+As III)/GW4(+As III),其中每一組最終分別鑒定到41、71、82和168個差異蛋白。通過EMSA和熒光定量PCR在GW4菌中一共鑒定出了12個啟動子具有AioR結(jié)合位點的基因,結(jié)合差異蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果及熒光定量PCR結(jié)果我們得出以下結(jié)論:1.AioR主要調(diào)控細菌的砷氧化,但可以同時調(diào)控其他與砷氧化相關(guān)的代謝通路;2.AioR通過調(diào)控細菌磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(Pst/Pho)從而使細菌可以更加經(jīng)濟有效的利用磷酸鹽(Pi),從而彌補磷酸鹽(Pi)的匱乏;3.AioR可以調(diào)控砷抗性基因(ars C、acr3)、肽聚糖再生基因anm K、脯氨酸合成基因pro C和修復(fù)蛋白基因PIMT,從而賦予細菌GW4高砷抗性;4.AioR可以調(diào)控TCA循環(huán),從而使細菌以砷氧化為主要產(chǎn)能途徑(圖B)。綜上所述,本研究鑒定到了首個As(III)趨化受體蛋白Mcp,并證明AioR可以調(diào)控細菌對As(III)的趨化和氧化,砷趨化和砷氧化密切相關(guān)。此外,本研究首次報道了加砷促長的異養(yǎng)砷氧化細菌的代謝路徑,并證明出AioR是砷氧化的主要調(diào)控蛋白,該蛋白同時也可以調(diào)控與砷抗性相關(guān)的代謝途徑中的一些基因的表達。該論文的結(jié)果加深了我們對細菌砷氧化機制的認識,具有重要科學(xué)價值。
【圖文】：

圖 1.2 雙組份調(diào)控系統(tǒng)的分類 (Groisman et al 2016)Fig. 1.2 Classes of two-component signal transduction systems (Groisman et al 2016)

圖 1.3 本研究分析的細菌砷基因島的基因排布的三種類型Fig. 1.3 Three of gene and operon arrangement of arsenic gene island in this study對于 GroupI 及 GroupII 的砷氧化細菌，細菌的砷氧化是受到三組份調(diào)控系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X703;X172

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2 李t熜

本文編號：2636263