【摘要】：城鎮(zhèn)用水和工業(yè)廢水處理中,生物下游工業(yè)及食品生產(chǎn)和發(fā)酵工藝中,絮凝過(guò)程是應(yīng)用最普遍的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,同時(shí)絮凝過(guò)程的研究趨勢(shì)也由過(guò)去側(cè)重工藝的優(yōu)化逐漸發(fā)展為現(xiàn)在側(cè)重藥劑的開(kāi)發(fā)。生物絮凝劑作為一種安全無(wú)毒、絮凝活性高、無(wú)二次污染的新型絮凝劑,對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境保護(hù)都有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。但是,目前大部分研究多處于實(shí)驗(yàn)室階段,而且產(chǎn)量低且生產(chǎn)成本高,在很大程度上限制了生物絮凝劑的生產(chǎn)和應(yīng)用�；诖�,本課題通過(guò)對(duì)產(chǎn)絮凝菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、生物絮凝劑的分離純化、組成結(jié)構(gòu)分析及合成代謝的研究,為生物絮凝劑的理論研究提供參考,也為生物絮凝劑的產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)保證。 采用平板劃線法對(duì)產(chǎn)絮性能退化的絮凝菌F2進(jìn)行復(fù)壯,復(fù)壯后的產(chǎn)絮菌F2所產(chǎn)生物絮凝劑的絮凝效果已恢復(fù)至原始菌的95%以上,且生長(zhǎng)旺盛,將其作為今后試驗(yàn)的出發(fā)菌株。采用三種方法對(duì)絮凝菌F2的生長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定,0-15h為指數(shù)生長(zhǎng)期,15-24h為穩(wěn)定期,24h后為衰亡期,其代時(shí)為44.1min。對(duì)絮凝菌F2發(fā)酵過(guò)程的溶解氧、pH值、菌體干重、生物絮凝劑活性成分含量、絮凝率、蛋白質(zhì)、葡萄糖、總氮及總磷進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè),并對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明K2HPO4是發(fā)酵培養(yǎng)基中必不可少的,且用量不能少于5.0g/L,而KH2PO4則可以選擇性的添加或不添加。根據(jù)絮凝菌F2發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)、底物葡萄糖的消耗和絮凝活性物質(zhì)合成變化,確定屬于產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型發(fā)酵。并基于Logistic方程和Luedeking-Priet方程建立了描述絮凝菌F2發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成和底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型。經(jīng)計(jì)算,三種模型均較準(zhǔn)確的模擬了其過(guò)程。 絮凝菌F2產(chǎn)生的生物絮凝劑大部分存在于胞外的培養(yǎng)液中,它是由微生物分泌到胞外的,其絮凝作用不是由菌體細(xì)胞產(chǎn)生的。生物絮凝劑具有一定的熱穩(wěn)定性,但隨著pH值的變化絮凝活性波動(dòng)較劇烈。同時(shí)對(duì)生物絮凝劑的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。以上結(jié)果都表明,生物絮凝劑中含有多糖和蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì),其中多糖含量明顯高于蛋白質(zhì)含量,多糖與蛋白質(zhì)含量比值為97.4: 2.2,且多糖為絮凝功能的主要承擔(dān)者。利用有機(jī)溶劑對(duì)生物絮凝劑活性成分進(jìn)行提取,確定了最佳提取條件為:濃縮倍數(shù)為1/2,乙醇濃度為100%,乙醇用量為1:2,沉淀時(shí)間為2h,沉淀pH值為6。經(jīng)初步提取的生物絮凝劑中含有大量游離蛋白質(zhì),利用法對(duì)有機(jī)溶劑提取后的生物絮凝劑去除蛋白質(zhì),確定了最佳去除游離蛋白質(zhì)條件為:V樣品:Vsevage為2:3,V氯仿:V正丁醇為5:2,時(shí)間為30min。生物絮凝劑經(jīng)初步分離提取后,蛋白質(zhì)的含量顯著降低。提取后得到的粗品溶解后呈淡黃色且較粘稠,絮凝活性有明顯提高。 根據(jù)生物絮凝劑的性質(zhì),選擇了三種弱陰離子交換凝膠DEAE Sephadex A-25、DEAE Sepharose Fast Flow和DEAE-650M對(duì)生物絮凝劑粗品進(jìn)行純化預(yù)試驗(yàn),從中選擇出一種最適合純化生物絮凝劑的離子交換凝膠DEAE-650M。對(duì)離子交換層析進(jìn)行洗脫速度、收集量和上樣量的選擇,最終確定了離子交換層析純化生物絮凝劑粗品的最佳條件為:DEAE-650M離子交換凝膠,2.6?20cm柱子,pH8.0 Tris-HCl起始緩沖液,0-1.5mol/LNaCl梯度洗脫,上樣量為6mL,洗脫速度為54mL/h,收集量為3mL/管。 絮凝菌F2產(chǎn)生的生物絮凝劑純化物為白色棉絮狀固體。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),只有一條藍(lán)色條帶。其紫外吸收光譜顯示,生物絮凝劑純品中具有蛋白質(zhì)和糖類(lèi)特征基團(tuán),且不含核酸類(lèi)大分子。生物絮凝劑純品的HPLC為單一峰,采用GPC法測(cè)定分子量,不同已知分子量的多糖作標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)計(jì)算分子量為1156,000Da。多糖的薄層層析、GC和GC-MS分析,均表明其主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成。紅外光譜圖表明其既含有蛋白質(zhì)的特征基團(tuán)氨基(或酰氨基),又含有糖的特征基團(tuán)羧基和羥基,單糖為?-型吡喃糖。1HNMR說(shuō)明生物絮凝劑活性中心多糖的每個(gè)重復(fù)單位中含有3個(gè)糖基單元,分別為α-吡喃型半乳糖、?-吡喃型甘露糖和α-吡喃型葡萄糖,它們的質(zhì)量比約為1:3:5,它們以α和?糖苷鍵相連,化學(xué)式為[C54H108O54]n。 根據(jù)生物絮凝劑的組成結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、絮凝菌F2對(duì)多種碳源和中間產(chǎn)物的利用情況,提出了一個(gè)絮凝菌F2合成生物絮凝劑途徑的假設(shè)。
【圖文】：

第 2 章 實(shí)驗(yàn)材料和方法①放走過(guò)量的溶液，讓溶液的液面降低到恰好在柱床表面上面（即液面與樹(shù)脂頂面相平）時(shí)，用長(zhǎng)滴管吸取適量生物絮凝劑粗提溶液樣品，沿繞色譜柱內(nèi)壁小心地加入（千萬(wàn)不要使樹(shù)脂床頂面收到樣品液的沖擊）。樣品加完后，打開(kāi)蠕動(dòng)泵，使柱內(nèi)溶液慢慢流出。待液面與樹(shù)脂頂面接近相齊時(shí)，用長(zhǎng)滴管吸取洗脫緩沖液（約 5-10mL）洗滌柱子的內(nèi)壁，使樣品都流入柱子內(nèi)。重復(fù) 2-3 次，確保樣品都流入柱子內(nèi)，待液面與樹(shù)脂頂面接近相齊時(shí)，關(guān)閉泵，在樹(shù)脂頂部小心加入3-5mL 洗脫緩沖液。②連接柱子和梯度混合儀，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)谋昧魉�，分部收集器收集�?4) 檢測(cè)每管中吸取 1mL 樣品，按照苯酚-硫酸法逐管測(cè)定多糖的含量。(5) 樹(shù)脂的再生分離結(jié)束后，用新鮮配制的 0.5-1.0mol/LNaCl 溶液洗脫。然后再用起始緩沖液平衡柱子后可再次加樣分離。

發(fā)現(xiàn)F2菌株的絮凝活性有明顯的下降，說(shuō)明F2有退化傾向。于是采用純種分離法中的平板劃線分離方法對(duì)F2菌株進(jìn)行分離純化，使菌種絮凝活性得到恢復(fù)。復(fù)壯結(jié)果分別見(jiàn)圖3-1，3-2，3-3和3-4。圖3-1 絮凝菌F2平板劃線分離Fig.3-1 Plate streaking of bioflocculant producing bacteria F2由圖3-1可看到，絮凝菌F2經(jīng)過(guò)48h的平板生長(zhǎng)，，得到了若干單菌落。其菌落呈圓形，菌落直徑較大，約2~3mm，顏色為乳白色，表面光滑，透明度差。為考察復(fù)壯后的絮凝菌F2的生長(zhǎng)狀況，將其單菌落首先接入到普通斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：X703.5

【引證文獻(xiàn)】

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1 馬放;段姝悅;孔祥震;陳旭;楊基先;王愛(ài)杰;;微生物絮凝劑的研究現(xiàn)狀及其發(fā)展趨勢(shì)[J];中國(guó)給水排水;2012年02期

2 徐琳;劉建軍;趙祥穎;;產(chǎn)微生物絮凝劑兼性厭氧菌株的篩選[J];食品工業(yè);2012年10期

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2 徐琳;產(chǎn)微生物絮凝劑菌株的篩選[D];山東輕工業(yè)學(xué)院;2012年

3 段姝悅;絮凝劑對(duì)菌絲球的改性研究[D];遼寧大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2632854