【摘要】： 本文通過選擇性富集培養(yǎng)，從上海煉油廠附近污染土壤中分離到兩株菲降解細(xì)菌，及一株可加速菲降解菌的菲降解速率的細(xì)菌，并對(duì)所分離菌株進(jìn)行了生化鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育研究，同時(shí)進(jìn)行了降解特性、代謝途徑、降解基因克隆及表達(dá)方面的研究，對(duì)菲的膜毒性機(jī)制進(jìn)行了初步的探討性研究。以期為建立有效的菲污染預(yù)警指標(biāo)體系和PAHs污染的生物修復(fù)提供有益的參考。 本研究所獲主要結(jié)論如下： 1、從石油污染土壤中篩選分離到兩株菲降解菌株，分別命名為ZP1和ZP2菌株，同時(shí)分離到一株可加速菌株ZPl對(duì)菲降解速率的菌株，命名為ZP5菌株。通過革蘭氏染色、細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)試、抗生素抗性實(shí)驗(yàn)、碳源利用實(shí)驗(yàn)、全細(xì)胞脂肪酸分析、G+C mol％含量分析以及16S rDNA序列同源性分析，證明ZP1、ZP2和．ZP5菌株這三株菲降解細(xì)菌應(yīng)分別屬于鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬及tistrella屬。其中菌株ZP1被鑒定為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌種(Sphingomonaspaucimobilis)的又一菌株，ZP2被鑒定為施氏假單胞菌種(Pseudomonas stutzeri)，這是首次報(bào)道施氏假單胞菌種菌株具有菲降解活性。 2、ZP1和ZP2兩株菲降解菌都有很好的溫度、pH及菲含量適應(yīng)性。少量蛋白胨、酵母膏及葡萄糖的加入可不同程度的加速兩株菌對(duì)菲的降解；氯化銨、硝酸銨和硫酸銨為氮源時(shí)對(duì)這兩株菌的菲降解速率幾乎沒有影響；菲濃度范圍從250 ppm到1000 ppm之間，ZP1和ZP2菌株都可良好生長(zhǎng)并快速降解菲；表面活性劑Brij 30和Trition 100在低濃度時(shí)對(duì)ZP2菌降解菲的速率有促進(jìn)作用，但對(duì)ZP1菌株的菲降解作用有明顯的抑制作用，Tween 80在實(shí)驗(yàn)的三個(gè)濃度梯度中對(duì)ZP1和ZP2均表現(xiàn)出一定的加速菲降解速度效應(yīng)。 3、酶活實(shí)驗(yàn)證明，ZP1和ZP2菌株都有較高的1，2．鄰苯二酚雙加氧酶2，3-鄰苯二酚雙加氧酶活性，特別是2,3-鄰苯二酚雙加氧酶活性。在兩個(gè)菌株的菲代謝過程中，都發(fā)現(xiàn)了鄰苯二甲酸代謝途徑中的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物1-羥基-2-萘甲酸和2-羥基-1-萘甲酸及鄰苯二甲酸，所以推測(cè)兩個(gè)菌株都是經(jīng)過鄰苯二甲酸途徑利用菲為碳源而實(shí)現(xiàn)對(duì)它的降解。 4、根據(jù)己知序列設(shè)計(jì)引物在菌株ZPl中擴(kuò)增得到芳香環(huán)經(jīng)化雙加氧酶鐵硫蛋白α大亞基編碼基因，命名為pha-ZP1，其在Genbank登陸號(hào)為EU082776，該基因全長(zhǎng)1287bp，編碼383個(gè)氨基酸。利用Cn3D4．1軟件和Swiss Model Workspace網(wǎng)絡(luò)工具(http：／／swissmodel．expasy．org)推導(dǎo)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其具有Rieske型[2Fe-2S]中心和單核鐵原子結(jié)合域這兩個(gè)在酶的催化功能上具有重要作用的保守結(jié)構(gòu)。并且其氨基酸序列與來自Sphingomonas yanoikuyae B1和Sphingomonasr sp．P2的鐵硫蛋白α亞基同源性高達(dá)97％。 5、根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物分別在菌株ZP1和ZP2中擴(kuò)增得到了各自的鄰苯二酚雙加氧酶基因，分別命名為phn—ZP1和phn-ZP2，它們?cè)贕enbank中的注冊(cè)登陸號(hào)分別為：EU082777和EU082777。利用Cn3D4．1軟件和Swiss Model Workspace網(wǎng)絡(luò)工具(http：／／swissmodel．expasy．org)推導(dǎo)了基因所編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。通過與已知基因序列和編碼氨基酸序列的比對(duì)，對(duì)兩段基因進(jìn)行了遺傳親緣分析。ZP1菌株C230基因phn—ZP1全長(zhǎng)797bp，編碼233個(gè)氨基酸，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和B鏈結(jié)構(gòu)，phn—ZP2基因全長(zhǎng)1047bp，編碼331個(gè)氨基酸，其二級(jí)結(jié)構(gòu)同樣主要為α螺旋和β鏈結(jié)構(gòu)。 6、通過基因重組將菌株ZP2的鄰苯二酚2,3-雙加氧酶編碼基因phn—ZP2在Rosetta進(jìn)行了成功表達(dá)，初步檢測(cè)結(jié)果顯示，重組菌株的酶表達(dá)活性要明顯高于出發(fā)菌株。 7、卵磷脂脂質(zhì)體作為模擬細(xì)胞膜被用來研究PAHs的跨膜特性和膜毒性。結(jié)果顯示，此類親脂性有機(jī)物在跨膜的過程中符合Nernst分配定律。從而可以計(jì)算出菲在卵磷脂脂質(zhì)體和水之間的分配系數(shù)。研究了離子強(qiáng)度、溫度、酸度等條件對(duì)分配作用的影響。此外，首次研究了菲在卵磷脂微囊與模擬細(xì)胞液之間的反分配作用。文中利用大腸桿菌及菲降解菌ZP1進(jìn)一步研究了菲在不同細(xì)菌上的跨膜作用。實(shí)驗(yàn)表明相對(duì)于大腸桿菌，，菲更容易進(jìn)入降解菌的細(xì)胞膜內(nèi)，而展開進(jìn)一步的降解；在膜上的累積從而導(dǎo)致膜通透性的降低，是芳香環(huán)類有機(jī)物表現(xiàn)毒性的可能原因；親脂性有機(jī)物菲通過分配作用富集到磷脂層，然后通過反分配作用從磷脂雙分子層進(jìn)入到細(xì)胞液，從而最終影響細(xì)胞的活性和功能。由以上實(shí)驗(yàn)得出跨膜屏障．結(jié)構(gòu)效應(yīng)(TBSE)理論，從而很好的解釋了有機(jī)物跨膜過程的行為和膜毒性。
【學(xué)位授予單位】：同濟(jì)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：X172

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉玲,王黎華;人肺組織中多環(huán)芳烴的代謝與肺癌相關(guān)性的研究[J];北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1987年04期

2 蘇麗敏,袁星;持久性有機(jī)污染物(POPs)及其生態(tài)毒性的研究現(xiàn)狀與展望[J];重慶環(huán)境科學(xué);2003年09期

3 蘇麗敏,袁星,趙建偉,楊萍;持久性有機(jī)污染物(POPs)及其歸趨研究[J];環(huán)境科學(xué)與技術(shù);2003年05期

4 楊傳孝,李原芳,黃承志;麗春紅G用于人血清樣品中總蛋白的共振光散射測(cè)定[J];分析化學(xué);2003年02期

5 崔玉霞,金洪鈞;微生物降解多環(huán)芳烴有機(jī)污染物分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備;2001年06期

6 聶麥茜,張志杰,趙桂芳,劉可,姜少亭;共基質(zhì)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌降解多環(huán)芳烴的作用研究[J];環(huán)境科學(xué)研究;2001年05期

7 韓力平,王建龍,施漢昌,錢易;生物強(qiáng)化技術(shù)在難降解有機(jī)物處理中的應(yīng)用[J];環(huán)境科學(xué);1999年06期

8 鞏宗強(qiáng),李培軍,郭書海,井欣,王新,張海榮;多環(huán)芳烴污染土壤的生物泥漿法修復(fù)[J];環(huán)境科學(xué);2001年05期

9 陳華林,陳英旭,王子健,沈夢(mèng)蔚,許云臺(tái);中國(guó)南方河流和湖泊沉積物對(duì)菲的吸附特性[J];環(huán)境科學(xué);2003年05期

10 鄭新,陳華林;底泥中多環(huán)芳烴的處理技術(shù)進(jìn)展[J];環(huán)境污染與防治;2002年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 夏穎;多環(huán)芳烴菲對(duì)微生物生態(tài)毒理研究、菲降解菌的分離鑒定及降解基因克隆與表達(dá)[D];浙江大學(xué);2004年

本文編號(hào)：2628236