【摘要】：氯代乙酰胺類(lèi)除草劑是一類(lèi)具有高效性、高選擇性芽前除草劑。它們?cè)谌蚍秶鷥?nèi)廣泛使用。其主要代表品種丁草胺和乙草胺,年使用量分別超過(guò)1萬(wàn)噸和3萬(wàn)噸,主要用于一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草的防除。該類(lèi)除草劑對(duì)魚(yú)類(lèi)有較強(qiáng)的毒性,其中丁草胺被美國(guó)環(huán)保局定為L(zhǎng)2類(lèi)致癌物。由于它們具有水溶性高、土壤殘留期長(zhǎng)的特點(diǎn),因此而導(dǎo)致的土壤殘留不僅影響后茬作物生長(zhǎng)還造成生態(tài)污染,所以環(huán)境中氯代乙酰胺類(lèi)除草劑的殘留引起人們的廣泛關(guān)注。已有研究表明微生物降解是消除環(huán)境中氯代乙酰胺類(lèi)除草劑的主要方式。因此本文以丁草胺為底物,分離篩選高效氯代乙酰胺類(lèi)除草劑降解菌株,研究其對(duì)丁草胺的代謝途徑及其克隆其中關(guān)鍵酶基因,從分子生物學(xué)水平上解析此類(lèi)除草劑的降解機(jī)制。一、丁草胺降解菌株的分離和降解特性的研究以丁草胺為底物,以江蘇常州水稻田采集的土樣作為接種物,通過(guò)連續(xù)富集培養(yǎng)的方法得到兩個(gè)能夠降解丁草胺的富集液Yl和Y3,從富集液Y1中分離到菌株B1,從富集液Y3中分離到菌株B2和N7。根據(jù)菌株的表型、生理生化特性和16S rRNA基因同源比對(duì),將菌株B1、B2初步鑒定為Rhodococcus sp.。菌株N7的分類(lèi)地位在本文的最后一章研究。菌株B1在5天內(nèi)對(duì)100 mg/L丁草胺的降解率為100%。菌株B2在12h內(nèi)對(duì)100mg/L丁草胺的降解率為94%。菌株B1、B2降解丁草胺的最適溫度和pH都為30℃和7.0。0.1 mM的Ag+、Ca2+、Ni2+和Hg2+對(duì)菌株B1降解丁草胺具有較強(qiáng)的抑制作用,其中以Hg2+、Ag+抑制作用最為強(qiáng)烈。0.1 mM的Ag+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Hg2+和Cu2+對(duì)菌株B2降解丁草胺具有較強(qiáng)的抑制作用,其中以Hg2+、Mn2+抑制作用最為強(qiáng)烈,而Mg2+則對(duì)菌株B1和B2降解丁草胺有一定程度的促進(jìn)作用。在菌株B1、B2降解丁草胺的過(guò)程中,通過(guò)GC-MS檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物是2',6'-二乙基-2-氯乙酰苯胺(CDEPA)。菌株B1、B2都不能繼續(xù)降解CDEPA。據(jù)此推測(cè)菌株B1、B2降解丁草胺通過(guò)切斷丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺環(huán)上N原子之間的C-N鍵(Ⅳ-脫烷基作用來(lái)降解)。菌株B1能降解甲草胺、乙草胺、丙草胺和丁草胺,然而菌株B2只能降解乙草胺和丁草胺,菌株B1比菌株B2有更廣的降解譜。因此,雖然菌株B1和B2都能通過(guò)切斷丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺環(huán)上N原子之間的C-N鍵來(lái)降解丁草胺,但是催化該過(guò)程的酶可能不一樣。在后續(xù)的研究中,我們將分別研究菌株B1、B2降解丁草胺的機(jī)制。菌株N7既不能降解丁草胺也不能降解CDEPA,但是它一直和菌株B2穩(wěn)定共存在富集液中。利用菌株B2降解丁草胺后的培養(yǎng)物(去除B2細(xì)胞)來(lái)培養(yǎng)菌株N7發(fā)現(xiàn)菌株N7的細(xì)胞濃度升高,據(jù)此推測(cè)菌株N7利用菌株B2降解丁草胺產(chǎn)生的除CDEPA以外的其他代謝產(chǎn)物生長(zhǎng)。二、菌株B1中的丁草胺降解酶Ch1H的純化及特性研究基于菌株B1的粗酶液可以在含有丁草胺的瓊脂平板上因降解丁草胺而產(chǎn)生水解圈的特性建立了一種定性檢測(cè)丁草胺降解酶的方法。通過(guò)DEAE-Sepharose fast flow凝膠層析、Q-Sepharose fast flow凝膠層析和PAGE切膠回收電洗脫等純化手段得到具有較高的丁草胺降解活性的丁草胺降解酶Ch1H,整個(gè)過(guò)程丁草胺降解酶純化了185.1倍,酶的比活達(dá)到114.8 U/mg,最終得率為16.1%,分子量大小在45 KDa左右。Ch1H可以通過(guò)Ⅳ-脫烷基作用降解丁草胺生成CDEPA,初步推斷為一個(gè)水解酶。Ch1H部分特性如下：降解丁草胺的最適溫度為30℃,最適pH為7.0, 1.0mM Hg2+, Ca2+和Ni2+強(qiáng)烈抑制了降解酶Ch1H活性,1.0mM Fe2+對(duì)Ch1H有較強(qiáng)的抑制作用,1.0 mM的Mg2+有促進(jìn)酶活的作用,酶活提高了1.1倍。降解酶Ch1H還可以降解甲草胺、乙草胺、丙草胺,Ch1H的最適底物為甲草胺,并且隨著底物苯胺環(huán)N上連接的側(cè)鏈長(zhǎng)度的增加催化效率逐漸降低,水解效率為：甲草胺乙草胺丁草胺丙草胺。我們嘗試了蛋白質(zhì)N端測(cè)序等方法克隆編碼Ch1H的基因,令人遺憾的是沒(méi)有成功。在將來(lái)的研究中,我們將繼續(xù)開(kāi)展這方面的工作。三、通過(guò)比較基因組的方法克隆菌株B2中與丁草胺降解相關(guān)的Ⅳ-脫烷基酶基因在LB平板上連續(xù)傳代菌株B1、B2的過(guò)程中,菌株B1的降解特性穩(wěn)定存在,而B(niǎo)2菌株會(huì)出現(xiàn)功能丟失的情況,我們將其丟失功能的一個(gè)突變株稱(chēng)為T(mén)B2。采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)菌株B2及突變菌株TB2進(jìn)行基因組框架圖測(cè)序。菌株B2測(cè)序草圖信息如下：Scaffolds452個(gè),堿基數(shù)量6,871,517 bp, ORFs 6,521個(gè)。菌株TB2測(cè)序草圖信息如下：Scaffolds 101個(gè),堿基數(shù)量6,716,155 bp, ORFs 6,411個(gè)。利用Omiga 2.0軟件分析兩株菌的基因組差別,結(jié)果顯示在菌株B2中的scaffold51的末端大約30 K的片段在TB2中沒(méi)有比對(duì)到,以此序列的不同區(qū)域?yàn)榛A(chǔ),設(shè)計(jì)四對(duì)引物,通過(guò)PCR的方法進(jìn)一步驗(yàn)證該片段在TB2中不存在。將菌株TB2中丟失的片段中所有可能的ORF編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)上的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相似性比對(duì),發(fā)現(xiàn)有一個(gè)基因簇由EthR、EthA、EthB、EthC、EthD五個(gè)基因構(gòu)成,其中EthR編碼屬于AraC/XylS家族的調(diào)節(jié)蛋白(37 KDa),與其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001 的 EthR (99%); EthA編碼鐵氧還蛋白還原酶組分(43 kDa),與其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001的EthA (99%); EthB編碼細(xì)胞色素P450氧化酶組分(44 kDa),與其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001的EthB (92%):EthC編碼2Fe-2S型鐵氧還蛋白組分(11 kDa),與其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001的EthC (99%); EthD編碼一個(gè)10 kDa的蛋白,與其相似性最高的是Rhodococcus ruberIFP2001的功能未知蛋白EthD (90%)。Rhodococcus ruber IFP2001是一株ETBE(乙基叔丁基醚)降解菌,它的EthRABCD基因簇負(fù)責(zé)ETBE的O上脫烷基功能(切斷C-O),因此,我們推測(cè)菌株B2的基因簇EthRABCD可能具有類(lèi)似的脫烷基功能,即切斷丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺環(huán)上N原子之間的C-N鍵(Ⅳ-脫烷基作用)。為了驗(yàn)證基因簇EthRABCD的功能,將EthRABCD基因簇(含原始啟動(dòng)子)克隆到穿梭載體pRESQ上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQEth1,將其導(dǎo)入突變株TB2,其恢復(fù)了降解丁草胺的功能。為此,我們認(rèn)為菌株B2的基因簇EthRABCD就是負(fù)責(zé)切斷丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺環(huán)上N原子之間的C-N鍵的功能(N-脫烷基作用),互補(bǔ)菌株TB2 (pQEthl)在不經(jīng)乙草胺誘導(dǎo)的情況下只能降解乙草胺和丁草胺,但是在乙草胺的誘導(dǎo)后還可以降解甲草胺和丙草胺。鑒于EthD在Rhodococcus ruber IFP2001菌株中是一個(gè)功能未知蛋白,我們又將EthRABC與pRESQ構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQEth2,將其導(dǎo)入突變株TB2,它沒(méi)有恢復(fù)降解丁草胺的功能,說(shuō)明基因EthD編碼的蛋白在降解中必不可少。其具體功能還需進(jìn)一步研究。為了將EthABCD在大腸桿菌中表達(dá),我們將其克隆到pET29a (+)上構(gòu)建重組質(zhì)粒(pET-EthABCD),將該質(zhì)粒導(dǎo)入菌株E. coli BL21中,使該菌獲得了降解乙草胺的功能,但活性很低。推測(cè)可能是由于密碼子偏嗜性導(dǎo)致的表達(dá)量過(guò)低。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR以EthB為靶標(biāo)基因,測(cè)定了EthB在氯代酰胺類(lèi)除草劑誘導(dǎo)和葡萄糖誘導(dǎo)條件下的轉(zhuǎn)錄情況,結(jié)果顯示EthB在甲草胺、乙草胺、丙草胺和丁草胺的誘導(dǎo)下,轉(zhuǎn)錄水平分別為葡萄糖誘導(dǎo)條件下的0.73倍,354倍,33倍和1.63倍,證明丁草胺和乙草胺可以誘導(dǎo)EthB的表達(dá),其中乙草胺誘導(dǎo)效率最高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),基因簇EthRABCD中的每個(gè)基因都受乙草胺的誘導(dǎo),在乙草胺的誘導(dǎo)下EthR、EthA、EthB、EthC和EthD的轉(zhuǎn)錄水平相比葡萄糖誘導(dǎo)下提分別提高了326倍、256倍、354倍、321倍和263倍。通過(guò)PCR的方法在B1菌株中沒(méi)有檢測(cè)到EthRABCD基因簇的存在,這進(jìn)一步證明了在菌株B1和B2中存在不同基因編碼的酶來(lái)催化丁草胺的脫烷基作用。四、菌株N7分類(lèi)地位的研究前文提到N7可以同菌株B2在以丁草胺為唯一碳源的富集液中穩(wěn)定存在,它是利用菌株B2降解丁草胺的產(chǎn)物生長(zhǎng)。對(duì)其16S rRNA基因序列相似性分析顯示,菌株N7與Sphingobacterium multivorum IAM14316T的相似性為97.49%,與Sphingobacterium canadense CR11T的相似性為97.11%,與Sphingobacterium屬中的其他細(xì)菌的相似性低于97%,且在系統(tǒng)分類(lèi)樹(shù)上菌株N7與Sphingobacterium multivorum IAM14316T、 Sphingobacterium canadense CR11T (AY787820) 和 Sphingobacterium siyangense SY1T(EU046272)構(gòu)成一個(gè)系統(tǒng)分類(lèi)分支。N7的主要的呼吸醌是MK--7、主要的脂肪酸是iso-C15:0(25.49%), C16:0 (7.92%), iso-C17:0 3-OH (6.98%),和summed feature 3 (comprising C16:1ω6c 和/或 C16:1 ω7c; 42.08%)、G+C含量為40.9±0.5 mol%,菌株N7與Sphingobacterium multivorum IAM14316T和Sphingobacterium canadense CR11T的DNA同源性分別為21%和15%,遠(yuǎn)低于70%(種間界定的閾值)。綜合其它的多相分類(lèi)數(shù)據(jù)確定菌株N7為Sphingobacterium屬的一個(gè)新種,我們將其命名為Sphingobacterium changzhouense N7T (= CCTCC AB 2012100T= KACC 16854 T)。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：X592;X172

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本文編號(hào)：2622987