【摘要】：擬除蟲菊酯(以下簡(jiǎn)稱菊酯)是人工合成的一類高效、廣譜、神經(jīng)致毒性殺蟲劑,被廣泛應(yīng)有于農(nóng)業(yè)病蟲害的防治和家庭衛(wèi)生害蟲的殺滅。作為高毒、難降解的有機(jī)磷和有機(jī)氯農(nóng)藥替代品,菊酯類除草劑在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用,目前菊酯類殺蟲劑占我國農(nóng)業(yè)殺蟲劑使用面積的三分之一以上。 相對(duì)有機(jī)磷和有機(jī)氯農(nóng)藥,菊酯類殺蟲劑對(duì)哺乳動(dòng)物低毒,環(huán)境危害較低。但最近的研究表明該類殺蟲劑對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)、生殖、免疫、內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)等仍有明顯的毒副作用；此外,菊酯類殺蟲劑對(duì)蜜蜂、魚類和水生無脊椎動(dòng)物等非靶標(biāo)性生物高毒,比如對(duì)魚的急性毒性濃度一般在μg/L級(jí)。 菊酯類殺蟲劑在環(huán)境中的殘留和降解越來越成為關(guān)注的焦點(diǎn)。以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)是一種環(huán)境友好型污染物消除技術(shù)。本研究擬從擬除蟲菊酯殺蟲劑降解菌的分離篩選入手,同時(shí)研究其降解途徑,通過易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)菊酯水解酶進(jìn)行體外定向進(jìn)化,獲得比酶活大幅提高的突變酶,解決了常規(guī)菌株難以降解聯(lián)苯菊酯的問題。 一、氯氰菊酯殺蟲劑降解菌的分離和鑒定 從生產(chǎn)菊酯殺蟲劑的廢水處理系統(tǒng)中分離到三株新菌株,分別命名為LQY-7T、LQY-18T和BA-3T。利用多相分類學(xué)技術(shù)對(duì)這三株菌的分類學(xué)地位進(jìn)行了研究。 菌株LQY-7T革蘭氏染色陰性,菌體桿狀,無鞭毛,無芽孢；菌落顏色為黃色,圓形并向上凸起,邊緣光滑,直徑2-4mm,并且粘著于平板上；細(xì)胞內(nèi)無非擴(kuò)散性黃色素。好氧,化能異養(yǎng)型。該菌株的呼吸醌為MK-6和MK-7；主要的脂肪酸為iso-C15:0, iso-C15:1 G, iso-C17:0 3-OH, anteiso-C15:0和iso-C15:0 3-OH; DNAG+C含量為34 mol%,將菌株LQY-7鑒定為Flavobacterium屬的一個(gè)新種,命名為Flavobacterium haoranii sp. nov.。 LQY-18T革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性,無鞭毛,無芽孢,在TSA瓊脂培養(yǎng)基上能夠形成的黃色、表面凸起、光滑濕潤,有邊緣規(guī)則的菌落；主要的呼吸醌為MK-7；主要的脂肪酸為summed feature 3 (C16:1ω6c and/or C6:1cω7c), iso-C15:0和iso-C17:0 3-OH);包含磷脂酰乙醇胺,鞘脂,未知氨基磷脂,未知氨基脂,未知脂；DNA G+C含量為40.3 mol%。通過以上多相分類結(jié)果和16S rRNA基因序列相似性分析結(jié)果,將LQY-18鑒定為鞘氨醇桿菌屬的一個(gè)新種,命名為Sphingobacterium wenxiniae sp. nov.。 菌株BA-3T革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性,無芽孢,桿狀,無鞭毛,在MLB固體培養(yǎng)基上茵落呈灰白色、圓形、邊緣規(guī)整、突起、不透明、質(zhì)地均勻,嚴(yán)格好氧；主要的脂肪酸是C16：0、C14：02 -OH和Summed feature 8 (C18:1ω6c and/or C18:1ω7c);所含極性酯主要為乙醇酸磷酯、磷脂酰甘油、雙磷脂酰甘油和神經(jīng)鞘糖脂類和鞘糖脂；主要的醌是Q-10,主要的多胺是亞精胺；G+C含量為63.8 mol%。因此根據(jù)表型及多相分類特征、16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育和DNA-DNA雜交分析,將菌株BA-3鑒定為鞘脂菌屬的一個(gè)新種,命名為江蘇鞘酯菌Sphingobium jiangsuense sp. nov.。 二、菊酯水解酶PytH的定向進(jìn)化 根據(jù)已報(bào)道的菊酯水解酶基因序列設(shè)計(jì)引物,通過PCR從降解菌株JZ-2中克隆到了菊酯水解酶pytH基因,pytH結(jié)構(gòu)基因共有840個(gè)堿基,編碼280個(gè)氨基酸序列。將pytH基因連接到表達(dá)質(zhì)粒載體pET29a上,在E.coli BL21實(shí)現(xiàn)了基因的高效表達(dá)。通過易錯(cuò)PCR對(duì)野生型pytH基因進(jìn)行隨機(jī)突變,獲得了1個(gè)聯(lián)苯菊酯水解活力增強(qiáng)的突變體LB37。和野生型PytH相比,突變體LB37有2個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變(Y19F,H127R),其水解聯(lián)苯菊酯的動(dòng)力學(xué)參數(shù)kcat和kcat/Km比原始PytH分別提高6和70倍。通過定點(diǎn)突變技術(shù),將野生型PytH的這兩個(gè)氨基酸突變?yōu)橄鄳?yīng)的突變體LB37氨基酸,獲得兩個(gè)突變體M19(Y19F)和M127(H127R),酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定結(jié)果表明,突變體M19的kcat/Km比原始PytH提高了5.5倍,M127的kcat/Km比原始PytH提高了14倍。 三、菌株JZ-2對(duì)3-苯氧基苯甲酸的代謝途徑研究 菌株JZ-2以3-PBA為唯一碳源生長時(shí),能夠在24小時(shí)內(nèi)完全降解100 mg·L-13-PBA；利用MS/MS技術(shù)檢測(cè)了該菌株降解3-PBA的代謝產(chǎn)物,并檢測(cè)了相關(guān)降解酶的酶活,結(jié)果表明3-PBA在3-苯氧基苯甲酸1,2雙加氧酶的作用下斷裂醚鍵生成鄰苯二酚和間羥基苯甲酸,鄰苯二酚經(jīng)1,2-雙加氧酶作用開環(huán)降解,而間羥基苯甲酸不能進(jìn)一步降解。這是一條不同于國內(nèi)外已有報(bào)道的3-PBA微生物降解代謝新途徑。 用MEGA分析軟件將已報(bào)道的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶基因進(jìn)行了同源性比對(duì),選擇高保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物,以菌株JZ-2基因組DNA為模板成功擴(kuò)增出約400bp的特異性條帶,通過在GeneBank上進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)該片段與咔唑降解菌Sphingomonas sp. KA1 plasmid pCAR3鄰苯二酚1,2-雙加氧酶(GeneBank Aeeession No. AB270530)同源性為98%,將catA基因的一個(gè)片段克隆至自殺性質(zhì)粒pJQ200SK,轉(zhuǎn)化至E. coli DH5αλpir中獲得同源重組載體pJQ-catA,通過三親接合轉(zhuǎn)入JZ-2中,通過同源重組單交換將pJQ200SK插入catA基因獲得突變子JZ-2-△catA.JZ-2-△catA失去了降解鄰苯二酚的功能,并且由于鄰苯二酚的反饋抑制使3-PBA降解速率下降,24h降解率約為30%,并且突變株不能在含有3-PBA的無機(jī)鹽平板上生長,進(jìn)一步證明了3-PBA是經(jīng)過鄰苯二酚的代謝過程被完全降解。 采用以sacB基因?yàn)榉聪蚝Y選標(biāo)記的同源重組載體,將3-HBA降解基因mbhDHIM整合到Sphingobium faniae JZ-2T的染色體上,構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定、不含外源抗性基因的可以完全礦化3-PBA的工程菌株JZ-2-mbhDHIM。 四、降解菌劑對(duì)菊酯污染的植株修復(fù)技術(shù)應(yīng)用 應(yīng)用菊酯農(nóng)藥降解菌劑進(jìn)行了浙江麗水茶葉的菊酯污染修復(fù)研究,通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)降解菌的降解效果與菌劑用量成正相關(guān),降解菌劑對(duì)不同類菊酯的降解效果有顯著差異,適量的降解菌劑對(duì)甲氰菊酯、氯氟氰菊酯有較好的降解效果,對(duì)溴氰菊酯降解效果較差。降解菌劑對(duì)甲氰菊酯、氯氟氰菊酯3d后降解率達(dá)60%以上,7d后降解率達(dá)70%以上,而對(duì)溴氰菊酯3d后降解率只有32.26%,7d后降解率56.21%,降解菌的使用時(shí)間以藥后1d傍晚處理效果最好。
【圖文】：

可以用PCR方法，目前以建立了多種以PCR為基礎(chǔ)的DNA定點(diǎn)突變及重組體產(chǎn)生的方法，重組PCR是主要的定點(diǎn)突變方法。重疊延伸PCR引入位點(diǎn)特異突變的大致過程如圖1一6所示，B、C引物中都引入了特定位點(diǎn)的突變，，且B、C引物相互互補(bǔ)。用A、B引物PCR擴(kuò)增出AB片段，用C，D

F19.2一 1BiodegradationofeyPermethrinbytheenrichment采用富集培養(yǎng)的方法，從揚(yáng)州農(nóng)藥廠的農(nóng)藥處理污水中獲得了富集液，富集液降解效果如圖2一1所示，從富集液中分離篩選獲得三株具有氯氰菊酷降解功能的菌株，命名為LQY一7、LQY一18和xQ一K，一株3一苯氧基苯甲酸(3一PBA)降解菌BA一3。2.2降解菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：X172

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2614432