【摘要】： 生物破乳劑是多種有效成分共存的復(fù)雜體系。目前對(duì)破乳有效成分缺乏足夠的認(rèn)識(shí),難于人工調(diào)控活性物質(zhì)的產(chǎn)量導(dǎo)致破乳能力不穩(wěn)定、效率不高是其無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的根本原因。系統(tǒng)分析生物破乳劑成分可使代謝調(diào)控、改善其破乳性能成為可能;同時(shí)尋找新的手段和方法提高破乳效率也可為生物破乳劑的發(fā)展注入新的活力。以破乳菌的分離、篩選為基礎(chǔ),摸索破乳菌培養(yǎng)條件,明確環(huán)境因素對(duì)其破乳效能的影響;深入研究生物破乳劑的破乳有效成分,優(yōu)化提取、純化手段,分離出破乳活性物質(zhì)并利用現(xiàn)代化表征技術(shù)加以解析;初步探討破乳菌株混合強(qiáng)化培養(yǎng)對(duì)破乳性能的提升。 結(jié)合生物表面活性劑的篩選方法及破乳性能測(cè)試,從大慶原油污染土壤中分離出一株高效破乳菌,經(jīng)16SrDNA鑒定,明確該菌為莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis),編號(hào)XH-1。通過(guò)破乳實(shí)驗(yàn)及生物量的測(cè)定,對(duì)影響破乳菌生長(zhǎng)和菌體發(fā)酵液破乳能力的培養(yǎng)條件進(jìn)行考察,使用MMSM培養(yǎng)基,得出最適于培養(yǎng)液破乳的發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基初始pH6.5,培養(yǎng)溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)140rpm,培養(yǎng)時(shí)間24h。該菌株培養(yǎng)液表現(xiàn)出優(yōu)良的破乳性能:室溫下,接觸時(shí)間48h,40%投加量可實(shí)現(xiàn)O/W模型乳狀液完全破乳;46℃下,接觸時(shí)間10h,排油率在80%以上;55℃下,接觸時(shí)間10h,排油率為100%。 通過(guò)對(duì)破乳活性成分分布及有效成分耐熱性、耐酸堿性的考察,借助紅外光譜、紫外可見(jiàn)光譜等分析手段確定蛋白類(lèi)物質(zhì)為該生物破乳劑的破乳有效成分之一,同時(shí)蛋白在溶液中的構(gòu)象對(duì)其破乳能力至關(guān)重要。破乳活性物質(zhì)存在于細(xì)胞外,粘連在菌體周?chē)蛴坞x于發(fā)酵液中,菌體本身不具有破乳能力。采用反復(fù)凍融手段及蛋白變性劑處理后,除菌上清液仍保持至少30%破乳活性,證明非蛋白類(lèi)組分在破乳過(guò)程中的作用。 提取破乳有效成分,通過(guò)對(duì)粗提產(chǎn)物破乳能力、產(chǎn)量的比較,選擇最佳粗提方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn):XH-1上清液中提取出的多糖、脂類(lèi)、脂肽類(lèi)物質(zhì)基本不具有破乳能力;25%~45%硫酸銨分離及有機(jī)溶劑沉淀法均可有效地將破乳活性物質(zhì)提取出來(lái)。使用乙醇沉淀法進(jìn)行粗提,提取產(chǎn)率高,產(chǎn)物破乳效果好,方法可重復(fù)性強(qiáng)。改進(jìn)提取工藝,粗提產(chǎn)率可達(dá)91%,室溫下48h粗提產(chǎn)物排油率接近100%。通過(guò)對(duì)粗提產(chǎn)物成分及分子量分布分析發(fā)現(xiàn):粗提物是多種蛋白、多糖等大分子物質(zhì)和分子量低于1000D的小分子產(chǎn)物共存的復(fù)雜體系。 選用HiTrap Butyl-S FF疏水相互作用層析,結(jié)合Superdex75凝膠排阻層析的分離方法,純化粗提產(chǎn)物,得到破乳活性物質(zhì)。純化產(chǎn)物溶液經(jīng)液相色譜分離得到單峰,通過(guò)質(zhì)譜鑒定確定為具有PEG結(jié)構(gòu)單元的小分子。這些物質(zhì)分子量分布范圍從200~1000D,在溶液中聚結(jié)為膠團(tuán),在破乳過(guò)程承擔(dān)重要作用。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)比較破乳能力不同組分間差異。酶切差異條帶后進(jìn)行質(zhì)譜分析,并在數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),得到四種蛋白,其中一種為疏水蛋白。確認(rèn)疏水蛋白為破乳有效成分之一,鑒定為Phosphate-binding protein。 將破乳菌XH-1與枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)在改進(jìn)的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中強(qiáng)化培養(yǎng)可以有效地提高生物破乳劑的破乳效率。強(qiáng)化培養(yǎng)液在室溫下,接觸時(shí)間48h可使O/W型模型乳狀液完全破乳。與單一菌株發(fā)酵全培養(yǎng)液相比,縮短了發(fā)酵時(shí)間(提高6h以上),降低了破乳劑投加量,提升了破乳能力和穩(wěn)定性。乳狀液pH 3~7的條件下,強(qiáng)化培養(yǎng)液可維持較高破乳活性。具有良好耐溫性,乳狀液溫度在20~120℃,破乳劑排油率變化率在15%以?xún)?nèi)。強(qiáng)化培養(yǎng)后,生物破乳劑仍主要依靠發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生代謝產(chǎn)物破乳,上清液排油效果為全培養(yǎng)液的87%。強(qiáng)化培養(yǎng)是提高破乳活性的更為簡(jiǎn)便、有效的手段。
【圖文】：

圖 1-1 詳細(xì)說(shuō)明了這兩個(gè)過(guò)程[44]。如圖1-1 所示，，由于細(xì)胞表面的活性，細(xì)胞表面能被原油乳狀液的非連續(xù)相（液滴） 充分潤(rùn)濕，又不是完全潤(rùn)濕，因此細(xì)菌細(xì)胞最終會(huì)在連續(xù)相和非連續(xù)相的界面上占據(jù)一個(gè)平衡位置，其一半以上浸入非連續(xù)相之中。在破乳過(guò)程中，非連續(xù)相的兩個(gè)單元（兩個(gè)乳狀液液滴，或者一個(gè)乳狀液液滴與一個(gè)已分層的非連續(xù)相）只要在同一個(gè)細(xì)胞表面接觸、潤(rùn)濕并鋪展，則這兩個(gè)單元在到達(dá)平衡前就會(huì)在細(xì)胞表面上凝聚。由于細(xì)胞尺寸一般要比聚合物等乳化劑的尺寸大若干數(shù)量級(jí)，加上其相對(duì)較高的表面活性，使液滴能較快地潤(rùn)濕、鋪展，使兩個(gè)液滴凝聚并排液。第04期 徐f槪閡恢昶迫榫迫橛行С煞址治黽捌淝炕嘌跫嘔

本文編號(hào)：2609907