【摘要】：城市景觀娛樂水體是水傳性病原微生物的重要生存環(huán)境和傳播介質(zhì),其微生物風(fēng)險與公眾健康密切相關(guān)。然而,目前對城市水體中人類細(xì)菌病原菌多樣性檢測、分布特征、風(fēng)險水平及來源解析的研究匱乏。本研究以北京市景觀娛樂湖泊及常州市15條城市河流為研究對象,利用本研究優(yōu)化改進(jìn)的基于16S rRNA基因高通量測序技術(shù)檢測細(xì)菌病原菌多樣性的方法,并結(jié)合qPCR技術(shù),研究了城市水體中的病原菌多樣性、時空分布特征、風(fēng)險水平及潛在來源,并分析了原位生態(tài)凈化/修復(fù)措施對細(xì)菌病原菌水平的潛在影響,為城市水體微生物安全管理提供研究基礎(chǔ)。本研究改進(jìn)了基于16S rRNA基因高通量測序技術(shù)檢測細(xì)菌病原菌多樣性的方法,通過集成涵蓋145個屬、303種病原菌種的數(shù)據(jù)庫,選擇更優(yōu)化的區(qū)域,將各屬菌種序列分辨比例平均提高22.7%,提升了已有數(shù)據(jù)庫的全面性和準(zhǔn)確性。對北京城市景觀娛樂湖泊病原菌多樣性研究發(fā)現(xiàn),水中主要檢出Acinetobactor johnsonii、Aeromonas spp.等環(huán)境病原菌。結(jié)合qPCR定量檢測Escherichia coli、Salmonella和三種環(huán)境病原菌Aeromonas spp.等,發(fā)現(xiàn)它們普遍存在,其中34.8%的水樣中檢出所測4種病原菌基因(E.coli除外)。微生物定量風(fēng)險評估發(fā)現(xiàn)劃船、玩水、喂魚等娛樂活動中Salmonella、Mycobacterium avium、Pseudomonas aeruginosa的年感染風(fēng)險大多高于美國環(huán)保署推薦限值0.032,其中兒童玩水感染風(fēng)險最高。針對常州市河流研究發(fā)現(xiàn),水中檢出的潛在病原菌多樣性與豐度明顯高于北京景觀娛樂湖泊,尤其是腸道病原菌,共檢出Arcobacter spp.和Bacteroides spp.等16種。結(jié)合qPCR對12種重要病原菌定量檢測,發(fā)現(xiàn)河水普遍受腸道病原菌污染,Arcobacter cryaerophilus、Campylobacter jejuni、Enterococcus faecalis大量檢出,且普遍高于其他研究報道的地表水水平。同時,A.johnsonii、Acinetobacter lwoffii和Aeromonas spp.等環(huán)境病原菌檢出豐度也較高,與湖泊中優(yōu)勢環(huán)境病原菌種類、豐度相近。城市河流生態(tài)修復(fù)設(shè)施(人工浮島)生物膜中檢出多種病原菌,且多數(shù)(9/12)病原菌的豐度高于或近似于河水;景觀湖泊人工濕地系統(tǒng)顯著增加了水中Aeromonas spp.的濃度,表明原位修復(fù)/凈化設(shè)施可能是水體中多種病原菌的貯存庫。城市河流中微生物源解析結(jié)果表明污水直排帶入人類糞便很可能是腸道病原菌的主要輸入途徑。腸道病原菌水平大多與人源微生物標(biāo)記物顯著相關(guān),但與水質(zhì)無確定關(guān)系,建議在管理中通過病原菌源解析或直接監(jiān)測確定污染水平及風(fēng)險。
【圖文】：

研究技術(shù)路線圖

4 章）以 Illumina 測序常用的 V4 可變區(qū)（約 250 bp）為目標(biāo)片段，到近期（第 5至 7 章）延長為覆蓋 V3 和 V4 兩個可變區(qū)（約 460 bp），增加了測序長度。為了明確優(yōu)化的效果，本研究對 23 個屬的數(shù)據(jù)庫中參考序列的 V34 區(qū)和 V4 區(qū)對病原菌種的區(qū)分效果進(jìn)行比較，如圖 3.1-3.3 及表 3.3 中各屬菌種間分辨率的比較，結(jié)果顯示 V34 區(qū)在所研究各屬中比 V4 區(qū)對菌種的分辨率均有所提高，平均提高 22.7%（±16.7%），尤其是在 Aeromonas、Mycobacterium、Acinetobacter、Legionella、Staphylococcus、Yersinia 等屬中分辨率有明顯提升，更有利于準(zhǔn)確篩選潛在病原菌。因此，通常為了獲得群落結(jié)構(gòu)信息只對 V4 區(qū)進(jìn)行測序，是不能滿足病原菌多樣性檢測要求的，，要盡可能選用更長的片段比如 V34 區(qū)進(jìn)行測定。其次，測序深度關(guān)系到數(shù)據(jù)產(chǎn)生量，與測序成本有關(guān)。Illumina 測序平臺的另個特點(diǎn)是大大增強(qiáng)了數(shù)據(jù)量產(chǎn)生的效率，即所謂高通量。隨著技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，適當(dāng)增加測序深度對病原菌多樣性結(jié)果的全面性有利。因此，本研究把測序深度從通常選取的平均 4-5 萬條/樣（第 4 章），增加為平均 10 萬條/樣（第 5章），甚至更高，可以提高測序方法對低豐度條帶的檢出靈敏性，約為 2-3 倍。
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R126.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳晶;張敏特;陳萍;鄧文;周新程;張文藝;;菌劑強(qiáng)化潛流濕地總氮總磷去除及功能菌特性[J];環(huán)境化學(xué);2015年12期

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本文編號：2601610