【摘要】：農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展引發(fā)除草劑過度使用,由此而引發(fā)的環(huán)境污染問題日益受到人們的關(guān)注。低效率吸收的除草劑經(jīng)過雨水淋溶后,導(dǎo)致大量的土壤殘留。作為自然界廣泛存在的分解者,微生物以其多變的適應(yīng)能力扮演著重要的土壤生態(tài)修復(fù)工具的角色。因此,除草劑降解微生物的研究已成為熱點。作為近年來世界范圍內(nèi)大量使用的除草劑之一,芳氧苯氧丙酸類除草劑2011年的銷售額占據(jù)了全球農(nóng)藥市場的2.1%,占據(jù)全部除草劑市場的4.8%。雖然除草劑的施用降低了農(nóng)田雜草危害,但是大量未吸收除草劑對環(huán)境造成了嚴重的殘留污染。本研究以精惡唑禾草靈降解中間體(R)-(+)-2-(對羥基苯氧基)丙酸[(R)-(+)-2-(4-HydroxyPhenoxy)Propanoate, HPP]為基質(zhì),從長期受污染的化工廠污泥中分離和篩選降解微生物,并通過對降解微生物降解代謝和遺傳背景的研究,為此類除草劑污染的土壤生態(tài)修復(fù)和抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的開發(fā)提供代謝研究基礎(chǔ)和微生物資源。從長期受污染的化工廠污泥中分離出能夠快速降解HPP的三株菌,命名為MEPE0129, MEPE0902和MEPE0903.根據(jù)表型特征、生理生化特性及16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析,分別將MEPE0129鑒定為紅螺菌科(Rhodospirillaceae gen.sp.)菌株,將MEPE0902鑒定為叢毛單胞菌科戴爾福特屬(Delftia sp.)菌株,將MEPE0903鑒定為產(chǎn)堿菌科的噬色素菌屬(Pigmentiphaga sp.)菌株。MEPE0129, MEPE0902和MEPE0903的生長需要氧氣,最適生長溫度均為37℃,最適生長pH分別為6.0-7.0,7.0和7.0。當NaCl;農(nóng)度小于3%時,菌體生長良好。16SrRNA基因同源性比對表明,MEPE0129的16SrRNA基因序列與目前報道菌株最高同源性僅為91.17%。建樹分析后發(fā)現(xiàn)該菌在紅螺菌科內(nèi)形成了一個新的分支,該分支不同于科內(nèi)其他屬的模式菌株。進一步對MEPE0129進行了Biolog系統(tǒng)和API系統(tǒng)分析。同時分析了該菌株的脂肪酸,G+C mol%含量,極性酯,呼吸醌成分。MEPE0129 DNA G+C含量為65.1 mo1%,主要呼吸醌為Q10(75%),主要脂肪酸組分為C18：1ω7c,C16：0和C19:0cycloG)8c。與同科其他屬模式菌株比較后,發(fā)現(xiàn)MEPE0129擁有獨特的生理生化特征。因此建立以MEPE0129為模式種的新屬,命名為Taonella mepensis (=CICC 10529T=CCTCCAB2012861T=KACC 16940T)。對MEPE0129, MEPE0902和MEPE0903分別進行了以HPP為唯一碳源,最適溫度,最適pH,不同接種量,不同基質(zhì)初始濃度和不同金屬離子條件的降解實驗。實驗結(jié)果表明MEPE0129可以在13 d內(nèi)利用50 mg·L-1生長,最高生長OD600nm可以達到0.1。MEPE0902可以在14h內(nèi)利用高達450 mg·L-1的HPP進行生長,相應(yīng)的菌株生長濁度OD600nm由0.027上升至0.53。MEPE0903可以在8天內(nèi)將50 mg.L-1的HPP降解96%,同時菌體干重上升至90 mg·L-1。MEPE0129, MEPE0902和MEPE0903的最適降解溫度分別為28℃,37℃和30℃,其中MEPE0129在低于28℃的低溫條件下有顯著降解。三株菌的最適降解pH分別為8.0,7.0和8.0,且都在偏堿環(huán)境中有良好的降解效果。不同初始HPP濃度實驗表明,高接種量的MEPE0129可以在6d內(nèi)降解125 mg·L-1的HPP, MEPE0902可以在15 h內(nèi)降解高達500 mg-L-1的HPP。而MEPE0903僅能降解50 mg.L-1的HPP,在100 mg·L-1及其以上濃度時,MEPE0903失去降解能力。不同初始接種量實驗表明,在選定的接種量范圍內(nèi),三株菌對于HPP的降解效率隨著接種量的升高而升高。金屬離子實驗表明,Cu2+和Ni2+對于三株降解菌的降解有抑制作用,而Co2+對于MEPE0902的降解抑制作用更加顯著。研究了MEPE0902中對苯二酚(HQ)的單獨降解,對苯二酚與HPP的誘導(dǎo)降解,對苯二酚與HPP的混合降解和HPP降解的中間產(chǎn)物。在50 mg·L-1對苯二酚的無機鹽培養(yǎng)基中,對苯二酚能被MEPE0902轉(zhuǎn)化為未知且無法利用的中間產(chǎn)物。對苯二酚和HPP的誘導(dǎo)和混合降解實驗表明,兩種物質(zhì)對于對方的降解沒有顯著影響。最終,通過濃縮降解發(fā)酵液的方法,我們檢測到了中間產(chǎn)物對苯二酚,確定了HPP在MEPE0902中的降解是以微量對苯二酚為中間代謝產(chǎn)物的新型降解途徑。為了研究MEPEO129和MEPE0902中多種可能的HPP降解代謝途徑,分析了降解菌中的偏苯三酚開環(huán)酶活性。實驗表明菌株MEPE0129和MEPE0902的破碎粗酶液具有偏苯三酚開環(huán)酶活性。利用保守引物以MEPE0129基因組DNA為模板擴增,得到了MEPE0129中偏苯三酚開環(huán)酶基因片段。繼而通過Sefa-PCR和Tail-PCR側(cè)翼擴增得到了6.8 k的芳香族化合物降解基因簇�？寺×送暾腗EPE0129偏苯三酚開環(huán)酶基因hppC,連接至pET-29a載體進行表達。表達的HppC比酶活低于粗酶中偏苯三酚開環(huán)酶比活,說明MEPE0129中可能存在其他的偏苯三酚開環(huán)酶。
【圖文】：

２．２菌株的菌落形態(tài)及生理生化特征逡逑分離菌株的茵落形態(tài)，光學顯微鏡形態(tài)和電子顯微鏡形態(tài)分別為圖２－１－３，逡逑圖２－１－４和圖２�。�。所分離的三株降解菌均為革蘭氏陰性菌。ＭＥＰＥ０１２９菌體為逡逑楠球形（圖２－１－３），菌體尺寸１．２－１．４邋｜ａｍｘｌ．５－１．７畔１，具有單極鞭毛，菌落為淡逡逑黃色，整齊圓潤。ＭＥＰＥ０９０２菌體為巧狀，菌體尺寸ｌ．0ｎｍｘ４．０－６．２畔１，無鞭毛，逡逑菌體表面具有較多的胞外分泌物（圖２－１－４Ｃ），菌落為不規(guī)則圓形，初期為白色逡逑至淡黃色，生長４－５邋ｄ后轉(zhuǎn)為紅色，菌落有較強粘性。ＭＥＰＥ０９０３菌體為楠圓形，，逡逑菌體尺寸１．０Ｘ０．５叫ｎ，相對較小，無鞭毛，菌體覆蓋大量外分泌物，使得菌體成逡逑團聚集（圖２－１－５Ｂ），小型無規(guī)則白色菌落。液體震蕩培養(yǎng)亦會形成絮狀菌團。逡逑２６逡逑

：羽逡逑圖２－１４菌株１＼４６口６０９０２形態(tài)照片（標尺，ｌ．Ｏ＾ｉｍ）逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋￣４邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｓｔｒａｉｎ邋Ｍ巨ＰＥ０９０２邋（Ｂａｒ，邋１．０邋ｊｉｍ）逡逑Ａ，菌株菌落形態(tài)；Ｂ，菌株光鏡下形態(tài)；Ｃ，菌株電鏡下形態(tài)Ａ，Ｔｈｅ邋Ｃｏｌｏｎｙ；邋Ｂ，Ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ逡逑ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｕ打ｄｅｒ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；邋Ｃ，邋Ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｕｎｄｅｒ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ逡逑２７逡逑
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：X592;X172

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬慰林 ,李中華;間一苯氧基甲苯的合成[J];華中師院學報(自然科學版);1983年01期

2 吳星;劉長慶;周建兵;徐建勝;單澤蘭;徐琴;;四苯氧基酞菁錳的化學及光化學性質(zhì)[J];揚州師院學報(自然科學版);1989年03期

3 鐘超凡，陳憲宏，鄧建成，童玨;三（2，4，6－三溴苯氧基）銻的合成與阻燃性能研究[J];湘潭大學自然科學學報;1995年04期

4 楊春文;1-對氯苯氧基乙�；�-3,5二取代物的合成研究[J];甘肅教育學院學報(自然科學版);1998年02期

5 邢光建,李佩珩,閻紅;3-[3-(1-哌啶甲基)苯氧基]丙胺的合成[J];廈門大學學報(自然科學版);1999年S1期

6 曹龍海;胡永玲;梁泰碩;;4,4’-雙(4-氨基苯氧基)聯(lián)苯的合成[J];黑龍江科學;2013年10期

7 劉曉玲,盛壽日,程彩霞,宋才生;合成4-苯氧基苯甲酸的新工藝研究[J];江西師范大學學報(自然科學版);2001年03期

8 楊芝萍;2,2-二甲基-5-(2,5-二甲苯氧基)戊酸合成反應(yīng)的研究[J];江西師范大學學報(自然科學版);2001年04期

9 黃知恒;嵇汝運;;1,5-雙(對甲(]喑

本文編號：2597895