【摘要】：多菌靈是一種苯并咪唑類殺菌劑,在很多國家廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)中的真菌病害。多菌靈還是苯菌靈和托布津殺菌劑的水解產(chǎn)物和活性成分。多菌靈在水中和土壤中非常穩(wěn)定,易于被植物根部吸收,導(dǎo)致糧食食物的污染。低濃度的多菌靈就會致突變、致癌和內(nèi)分泌紊亂,因此其污染受到人們的關(guān)注。而微生物降解是自然界中多菌靈降解的主要方式。本論文對一株多菌靈降解菌株dj1-6-2進行了系統(tǒng)分類學(xué)的鑒定,對其降解多菌靈及其下游產(chǎn)物2-氨基苯并咪唑的降解特性和降解途徑進行了研究,為闡明該菌對多菌靈降解機制,以及在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供依據(jù)。 菌株dj1-6-2部分生物學(xué)特性如下：該菌生長的最適溫度和pH分別為30℃C、pH7,能夠耐受7%的NaCl。其細胞壁組分中具有分類學(xué)意義的氨基酸為：tmeso-DAP,丙氨酸,谷氨酸,甘氨酸,天門冬氨酸。糖類型為核糖,阿拉伯糖和半乳糖等。磷脂為：DPG,PE1, PG, PE, PIM, PI, PME和CL。菌株dj1-6-2中主要的醌為MK-8(H2),含有枝菌酸。主要脂肪酸組成為C14：o(9.95%),C15：o(1.25%),C16：o(36.77%),C17：1ω8c(1.44%),C18：1ω9c(27.29%),C18：0(4.89%)和10-methyl C18:0 (tuberculostearic acid, TBS A) (3.70%).DNA G+C mo1%含量為60.1%.菌株dj1-6-2與其親緣較近的紅球菌屬模式種R.qingshengii djl-6T, R. baikonurensis DSM 44587T, R. erythropolis DSM 43066T和R.globerulus DSM 43954T的DNA-DNA雜交同源性分別為27.65%,19.29%,18.64%和10.59%。通過對菌株dj1-6-2的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析、氨基酸、糖組分、磷脂成分、細胞壁脂肪酸成分、醌、枝菌酸和DNAG+Cmol%含量等結(jié)果綜合分析,菌株djl-6-2屬于紅球菌屬的一個新種,命名為家玲紅球菌Rhodococcus jialingiae sp. nov.djl-6-2T(=DSM 45257 T= CCTCC AA 208292T)。 菌株dj1-6-2能夠在96 h降解97.88% 100 mg·L-1的多菌靈,并利用其作為唯一碳氮源生長；最適降解溫度和pH分別為30℃,pH7。建立了快速定性檢測多菌靈降解酶活性的多菌靈瓊脂糖平板法。研究了菌體破壁方法對粗酶得率和比酶活的影響,發(fā)現(xiàn)超聲破碎法獲得的總蛋白濃度最高,比活力也最高；酶的誘導(dǎo)性和定域研究表明,降解多菌靈的酶為組成型胞內(nèi)酶。多菌靈降解酶本身在15℃～45℃和pH6～pH8的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；酶降解多菌靈的最適溫度為30℃C,最適pH值為7.0。金屬離子Zn2+、K+、Fe3+對多菌靈降解酶有抑制作用,其他離子作用不明顯。高濃度的表面活性劑Tween 80、SDS和低濃度Triton X-100對酶也有抑制作用。酶抑制劑苯甲基磺酰氟化物有強烈的抑制作用。通過高效液相色譜和MS/MS分析發(fā)現(xiàn)2-氨基苯并咪唑和2-羥基苯并咪唑是菌株dj1-6-2降解多菌靈的代謝產(chǎn)物。 進一步研究菌株djl-6-2對2-氨基苯并咪唑的降解時,發(fā)現(xiàn)2-氨基苯并咪唑在無機鹽培養(yǎng)基中的降解率只有3.7%,在缺少NH4N03的無機鹽培養(yǎng)基中降解率達到97.3%,而且添加葡萄糖能夠促進菌株對其降解。在無氮培養(yǎng)基中,菌株對2-氨基苯并咪唑降解的最適溫度是30℃C,降解的最適pH值為7,金屬離子Mn2+,Fe2+有能促進菌株dj1-6-2對2-氨基苯并咪唑的降解作用,而Fe3+、Hg2+和A13+有抑制作用。菌株在降解100 mg·L-1 2-氨基苯并咪唑的過程中會出現(xiàn)2-羥基苯并咪唑的大量積累,10 mg·L-1時則沒有積累。雙加氧酶的抑制劑3-氟鄰苯二酚抑制2-羥基苯并咪唑的轉(zhuǎn)化速度。多菌靈、2-氨基苯并咪唑(2-AB)和2-羥基苯并咪唑(2-HB)能夠誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生兒茶酚2,3-雙加氧酶。 對2-氨基苯并咪唑的降解產(chǎn)物進行MS/MS分析時,發(fā)現(xiàn)了苯并咪唑(m/zl 19[M+H]+)、2-羥基苯并咪唑(rn/z135[M+H]+)的分子峰,以及三個有意義的疑似代謝產(chǎn)物的峰分別為二羥基苯并咪唑(m/z151[M+H]+)、三羥基苯并咪唑(m/z167[M+H]+)和一外二元醇雙加氧酶開環(huán)物質(zhì)m/z199[M+H]+。 進一步用PCR的方法從菌株djl-6-2中克隆了一個外二元醇雙加氧酶基因edo,重組表達產(chǎn)物能催化鄰苯二酚和2,3-DHBP開環(huán)；進一步在E.coli BL21(DE3)中進行了高效表達,發(fā)現(xiàn)外二元醇雙加氧酶(EDO)能夠促進菌株dj1-6-2的粗酶降解2-羥基苯并咪唑。因此推測,EDO有可能是菌株djl-6-2降解2-羥基苯并咪唑過程中參與開環(huán)的酶。
【圖文】：

5.3微生物對多菌靈的降解在土壤和水體中，盡管多菌靈能夠在物理和化學(xué)的過程緩慢降解，然而微生物代謝是多菌靈降解的主要途徑(wHO，1993)。目前，多菌靈降解菌的分離研究一直是人們研究的熱點。國外，F(xiàn)uchs和devries(l978)曾報道假單胞菌只能夠轉(zhuǎn)化多菌靈為2一氨基苯并咪哇，但是不能夠完全降解多菌靈。Holtman和Kobayashi等(1997)曾報道分離五株紅球菌(RhodococcussP.)，能夠15d后降解完無機鹽培養(yǎng)液中的多菌靈(16mg·L一’)。PattanasuPong等(2004)從日本的稻田中分離得到的微生物聚生體，在5.5d后可完全降解多菌靈。Anchana等(2004孔b)也報道了采用混菌同時降解多菌靈和2，4一D，但卻未能分離出有效的多菌靈降解純菌。國內(nèi)，張桂山等(2004)分離到的羅爾斯通氏菌(RalstoniasP.)能夠以多菌靈作為唯一碳氮源生長，，在500mgL一，多菌靈無機鹽培養(yǎng)基中的24d降解率為19.16%，加入酵母膏后達到95.96%。張麗珍等(2006)分離篩選出一株短小芽抱桿菌Bacilluspumilus

圖1-Fig.1一55多菌靈在紅球菌djl一6中的代謝(Xu，etal.2007)ThedegradationofMBCinstraindjl一6(Xu，etal.2007)多菌靈微生物降解研究及應(yīng)用存在的問題多年來，多菌靈一直用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的病害防治中，引起農(nóng)作物病害的靶標(biāo)生對其產(chǎn)生了抗藥性;人們?yōu)榱诉_到防治病害的效果加大了用量，導(dǎo)致土壤中多
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：X172

【參考文獻】

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本文編號：2594650