【摘要】： 作為普遍存在于各類(lèi)生物細(xì)胞內(nèi)的解毒酶,細(xì)胞色素P450與難降解有機(jī)物的生物轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。白腐真菌的模式菌種黃孢原毛平革菌是目前所知的P450基因最豐富的真菌,但目前對(duì)該真菌P450的降解功能卻缺乏研究。 本研究在優(yōu)化黃孢原毛平革菌P450分離檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,分析多種難降解有機(jī)污染物對(duì)該真菌P450的誘導(dǎo)作用,利用P450光譜特性和微粒體P450反應(yīng)特征揭示該真菌P450的降解功能,綜合利用色譜、質(zhì)譜、光譜手段及P450抑制劑探討P450在該真菌總體降解過(guò)程中的作用及其與其它降解酶系的關(guān)系。 黃孢原毛平革菌P450適宜的分離檢測(cè)方法是:采用高速分散結(jié)合玻璃研磨破碎細(xì)胞、經(jīng)差速離心分離微粒體,采用CO結(jié)合差光譜檢測(cè)并嚴(yán)格控制通氣與還原條件。 正己烷、苯巴比妥、苯甲酸、氯代苯甲酸、甲苯、氯苯、2,4-二氯酚、五氯酚、菲、萘等物質(zhì)對(duì)黃孢原毛平革菌P450均有明顯的誘導(dǎo)作用,誘導(dǎo)后微粒體P450含量達(dá)37~137pmol/mg;P450的誘導(dǎo)量受營(yíng)養(yǎng)條件、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)方式等因素的影響而有明顯變化。 黃孢原毛平革菌P450對(duì)苯甲酸的降解活性可達(dá)29mol/(min·mol P450),胞外酶液中的錳過(guò)氧化物酶無(wú)法降解苯甲酸,抑制P450對(duì)苯甲酸降解效率沒(méi)有明顯影響,該真菌中存在其他苯甲酸降解酶系。該真菌P450對(duì)五氯酚的降解活性可達(dá)179mmol/(min·mol P450);在營(yíng)養(yǎng)豐富條件下,五氯酚的降解主要依賴(lài)甲基轉(zhuǎn)移酶,抑制P450會(huì)使甲基轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng);在營(yíng)養(yǎng)限制條件下,五氯酚的降解主要依賴(lài)甲基轉(zhuǎn)移酶和錳過(guò)氧化物酶,抑制P450對(duì)五氯酚降解沒(méi)有明顯的影響。該真菌P450對(duì)菲的降解活性可達(dá)638mmol/(min·mol P450);在營(yíng)養(yǎng)豐富條件下,菲的降解依賴(lài)P450參與催化的二氫二醇途徑,抑制P450會(huì)明顯降低菲的降解效率;在營(yíng)養(yǎng)限制條件下,菲的降解依賴(lài)P450和錳過(guò)氧化物酶,抑制P450會(huì)明顯降低菲的降解效率和菲-反-9,10-二氫二醇的生成,但不會(huì)影響錳過(guò)氧化物酶的活性。此外,抑制劑試驗(yàn)表明P450會(huì)參與該真菌對(duì)萘、芘、2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚的降解,并可能發(fā)揮著重要作用。
【圖文】：

保留時(shí)間(min)菌接種至 LN 培養(yǎng)基在 37℃130r/min 培養(yǎng) 60h 后加菲 112μmol/L，誘導(dǎo) 24h微粒體與菲的反應(yīng)體系加菲 112μmol/L 在 37℃反應(yīng) 48h；樣本編號(hào)與表 6黃孢原毛平革菌微粒體 P450 降解菲的產(chǎn)物分析（HPLC-MS 色譜營(yíng)養(yǎng)豐富條件下菲的降解及P450的作用研究表明黃孢原毛平革菌另一菌株 ME-446（ATCC 34541），，在降解菲的主要產(chǎn)物包括菲-反-9,10-二氫二醇、菲-反-3,4-二氫二D-吡喃葡萄糖苷、9-菲酚、3-菲酚、4-菲酚等，但尚未明確 P450 研究采用黃孢原毛平革菌模式菌株 BKM-F-1767，已發(fā)現(xiàn)菲能誘，并明確了該真菌 P450 能夠降解菲；本節(jié)將分析該真菌在 PDB的產(chǎn)物，探討黃孢原毛平革菌不同菌株中菲降解途徑及 P450 作用抑制劑試驗(yàn)分析 P450 的作用。 黃孢原毛平革菌降解菲的效率與產(chǎn)物

0200 250 300 350 400波長(zhǎng)(nm)0.000200 250 300 350 波長(zhǎng)(nm)0接種至 LN 培養(yǎng)基在 37℃130r/min 振蕩培養(yǎng) 60h 后，投加菲 112μmol/L圖中產(chǎn)物編號(hào)與圖 6.13 相對(duì)應(yīng).14 黃孢原毛平革菌 LN 培養(yǎng)基中菲降解產(chǎn)物的紫外吸收光譜
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：X172

【引證文獻(xiàn)】

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1 潘翠;瑞香狼毒內(nèi)生真菌C1Y74的形態(tài)和分子鑒定及對(duì)宿主成分的降解作用[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2591302