【摘要】：近年來由于抗生素的廣泛應用治療各類感染,使細菌耐藥問題越來越嚴重,從而導致了細菌多重耐藥性(Multidrug resistance, MDR)的現(xiàn)象。不斷的濫用抗生素使得人體乃至自然環(huán)境為細菌進化為多重耐藥性細菌提供了選擇壓力并使細菌耐藥性得以廣泛的傳播。整合子是一種可移動元件,在整合酶作用下,識別重組位點,通過位點特異性重組剪切、捕獲并整合細胞外游離的基因盒,并借助整合子的強啟動子使功能性基因得以表達的遺傳系統(tǒng)；整合子的基因盒大部分是具編碼多種水解酶或修飾酶、外排泵等與細菌耐藥性相關基因。 臨床上具有不同耐藥基因的致病菌會以各種方式流入環(huán)境中,環(huán)境細菌通過基因的水平轉移,可以從流入環(huán)境中的臨床致病菌中獲得耐藥性基因。在耐藥基因轉移過程中,往往會發(fā)生突變或重組,進而產生新的耐藥基因或新的多重耐藥性基因的組合。反過來,這些新的耐藥因子有可能再從環(huán)境細菌轉入臨床致病菌,經過空氣、食物或水來感染人體,在臨床上產生耐藥性,對人類健康具有極大的危害。在抗菌藥物選擇壓力環(huán)境下,整合子隨轉座子、接合性質粒一同發(fā)生水平轉移具有使耐藥性在細菌之間傳播的功能,是細菌競爭生存、適應環(huán)境的機制之 也是耐藥性傳播的重要途徑。 我們這項研究是通過調查濟南地區(qū)醫(yī)院周邊生活廢水中整合子細菌的發(fā)生率以及其含有的耐藥基因盒結構,目的是發(fā)掘、鑒定一些新型的整合子結構。從基因水平上分析細菌的耐藥及其轉移的機制,說明抗菌藥物濫用的危害性從而指導抗菌藥物的正確使用,防止抗菌藥物的濫用；根據細菌耐藥的機制,有目的的開發(fā)一些新型抗菌藥物。 本文主要的工作內容及結果如下： 1.通過濾法從濟南市區(qū)廢水環(huán)境中篩選耐藥性細菌,對所有耐藥性菌株的1型、2型、3型整合酶通過PCR分別進行檢測 從2008年至2009年各大醫(yī)院廢水處理廠周邊的廢水樣品；濟南齊魯制藥廠下游小清河地下水、工程改造地下抽去的排水及藥廠豬圈廢水；廢水處理廠處理前廢水及部分天然少污染的濟南周邊泉水共15個不同時間的樣品進行分析。篩選出391株不同耐藥性腸桿菌菌株,根據CLSI標準,通過抗菌藥物敏感性實驗分析菌株對常用抗菌藥物耐藥性,發(fā)現(xiàn)菌株對氨芐西林、甲氧芐啶、硫代異唑的耐藥性大于85%。通過1、2、3型整合酶引物intI1F/R,intI2F/R和intI3F/R進行PCR檢測,其中1型整合子比率為59.3%,2型整合子的比率為9.2%,未篩選到3型整合酶陽性的菌株。391株菌株藥物敏感性結果與整合子篩選結果分析發(fā)現(xiàn),含有整合子的耐藥細菌對氨芐西林、甲氧芐啶和硫代異唑三種抗菌藥物的耐藥率高達90%以上,非整合子細菌氨芐西林的耐藥性也高達87.2%,除了磷霉素外,耐藥性含整合子細菌比不具有該結構的菌株耐藥性的比率高10%-20%。 2.對1型整合子可變區(qū)采用PCR擴增,通過PCR產物大小、PCR產物RFLP圖譜分析及測序結果機型分析 根據1型整合子可變區(qū)根據其保守的5'CS和3'CS設計引物hep58,hep59進行擴增。根據PCR產物大小從0.2kb至6.3kb,PCR產物EcoRⅡ酶切圖譜分析,發(fā)現(xiàn)34種不同酶切圖譜,測序結果發(fā)現(xiàn)35種不同的基因盒陣列,具有42種不同的基因盒。35種基因盒陣列中九種基因盒陣列屬于新的排列組合,16SrRNA分析,九株菌包含6個屬：氣單胞菌屬、克雷伯菌屬、大腸桿菌屬、從毛假單胞菌屬、普羅維登斯菌屬和奇異變形桿菌屬。9種新型基因盒陣列如下所示：orfI；arr3--dfrA27；aadA△16—acc(6')-Ⅱ；aac(6')-Ib—bIaoXA-1—catB3；aacA4—orfun—aacA4—catB3 dhfrV—aac.(6—Ⅱ—nitr1—nit2—catB3—blaOXA-1；aac(6')-Ib-cr—arr3—dfrA27—aadA16—IS26；aadB—cat—blaOXA-10—aadAl—dfrAl—aacA4；aadB—cat—blaOXA-10—aadAl—orfll.232株具有1型整合子的基因盒陣列中,dfrA17—aadA5排列方式是最多的一種,占43.5%,其次是dfrA12—orfF—aadA2陣列,占19.3%。 3.對共篩選出36株2型整合子進行分析,其中含有5種不同的基因盒排列組合,接合轉移及轉化方法分析2型整合子的水平轉移性 用于擴增2型整合子可變區(qū)hep74和hep51引物成功擴增到5種不同的PCR產物4.3kb,3.0kb,2.5kb和2.2kb及時隱時現(xiàn)的2.5kb片段大小。PCR產物連接至pMD19-T測序結果顯示分別為linF—dfrAl—aadAl—orf441；dfrA1—catB2—sat2—aadA1; estXvr—sat—aadA1; dfrA1—sat2—aadA1及雜合型的dfrA1—sat2—aadA1—qacH基因盒陣列。36株2型整合子細菌根據REP圖譜進行分類,發(fā)現(xiàn)其可以分為15類,16S rRNA測序結果顯示19株屬于奇異變形桿菌屬,大腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬各7株,費氏檸檬酸桿菌、志賀氏菌屬、不動桿菌屬各1株。接合轉移、轉化實驗及脈沖場電泳及Southern雜交實驗結果表明除E.coli C4雜合型2型整合子外,其余新型2型基因盒陣列均位于染色體上。采用Tn7類轉座子特有序列tnsD, tnsE進行檢測,除2株雜合型2型整合子不具有此類保守序列外,其余34株2型整合子均屬于Tn7轉座子家族。在雜合型2型整合子下游鑒定存在IS26, tnp440和sul3基因。 4. Aeromonas puctata中新型喹諾酮耐藥性基因qnrVC4的克隆及活性分析 從Aeromonas puctata基因盒3.3kb aacA4—orfun—aacA4—aatB3比對結果發(fā)現(xiàn)中間lkb序列功能未知,具有218氨基酸的開放閱讀框,GenBank比對結果顯示其與QnrB6, QnrA1, QnrS1, QnrC, QnrVC1和QnrVC3具有45%-81%的相似性。根據核苷酸、氨基酸序列相似性及其attC重組位點進行了詳細的分析,根據qnr基因命名的法則,將此基因命名為qnrVC4。接合轉移和轉化實驗均未獲得該菌株相應的轉移子。采用堿裂解法提取質粒,脈沖場電泳,23S rRNA探針雜交對染色體定位,然后用qnrVC4探針進行雜交分析,結果表明該基因位于 大質粒上,并且該質粒不可以發(fā)生水平轉移。利用pBC KS(+)的Lac啟動子及整合子本身的啟動子PcWTGN-10進行表達。將657bp的qnrVC4及含有啟動子、aacA4、qnrVC4基因的1.8kb的PCR產物克隆至質粒pBC KS(+)中,在E.coli Top 10中成功構建重組子pBCKS-qnrVC4和pBCKS-Pt-qnrVC4。重組子pBCKS-qnrVC4對環(huán)丙沙星、加替沙星、萘啶酮酸最小抑菌濃度(MICs)結果分別為0.032,0.047和4 gg/mL；重組子pBCKS-Pt-qnrVC4結果分別為0.008,0.006和2μg/mL。分析此菌株染色體上GyrA, GyrB和ParC的喹諾酮耐藥性決定區(qū)域(QRDR)發(fā)現(xiàn)GyrA Ser-83-Ile突變是該菌株喹諾酮耐藥性的主要原因。 5.分析391株耐藥細菌中質粒介導的喹諾酮耐藥性基因qnrA, qnrB, qnrS的分布 雖然QnrA, QnrB和QnrS蛋白在喹諾酮耐藥性的貢獻非常小,但是qnrA,qnrB和qnrS通常位于質粒上并成為喹諾酮耐藥性水平轉移的主要方式,并且此類基因的水平轉移為獲得高喹諾酮耐藥性提供可能。從391株篩選的不同耐藥菌株中31株具有qnr類基因,其中2株具有qnrA基因；9株具有qnrS基因陽性菌株；17株qnrB基因陽性菌株,3株同時含有qnrB, qnrS基因。通過兩對引物進行PCR,并且通過PCR-RFLP的方法對qnrB基因變體進行了詳細的分析,此分析法的結果與測序結果相一致,可以用來大量快速鑒定qnrB基因變體并發(fā)現(xiàn)新型qnrB變體。與喹諾酮耐藥性相關的aac(6')-Ib-cr基因與qnr基因同時存在可以提高喹諾酮耐藥性,在31株菌中檢測到12株菌具有該基因。與喹諾酮相關的外排泵基因qepA僅在1株qnrB菌株中和4株qnrS菌株中檢測到。接合轉移和轉化實驗結果發(fā)現(xiàn)18株菌株的qnr基因可以發(fā)生水平轉移。 6.調查391株耐藥性菌株中ISCR1介導的復雜結構的1型整合子及具有該元件菌株的耐藥性機制分析 本實驗調查了391株菌株含有ISCR1元件的概率,發(fā)現(xiàn)其中有41株具有ISCR1元件,包括所有含有qnrA, qnrB的菌株。采用ISCR1元件的保守序列設計引物513BF和3'CS的qac△EB引物及SEFA-PCR分析ISCR1元件下游所攜帶的耐藥性基因,從中發(fā)現(xiàn)了11種不同的結構,包括ISCR1—qnrA—ampR—qac△E—sull, ISCR1—qnrB2—qac△E—sull, ISCR1—qnrB6—qac△E—sull, ISCR1—dfrA10—qac△E—sull, ISCR1—tnpU—armA, ISCR1—dfrL—qac△E—sull, ISCR1—dfrM—qac△E—sull, ISCR1—dfrN—qac△E—sull, ISCR1—dfrA19—intI1—aatB3—aadB—qac△E—sull, ISCR1—blaPER-1—gst—ABC transporter—orf252—qac△E, ISCR1—IS630—blaPER-1—gst—ABC transporter—arf52—qac△E等結構。模擬3種新型的DHFR家族(DfrL, DfrM, DfrN)位于ISCR1元件下游的遺傳結構,對甲氧芐啶最小抑菌濃度進行分析,耐藥性均大于1024μg/mL。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：X703

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳睿佳;張曉君;毛躍建;岳思青;趙立平;;喹啉降解反應器菌群內整合子檢測和菌株耐藥性分析[J];微生物學通報;2011年07期

2 李明成;李凡;;污水中大腸埃希菌攜帶第1類整合子的鑒定和特征分析[J];現(xiàn)代預防醫(yī)學;2006年02期

3 王春艷;黨宏月;丁永生;;膠州灣多重耐藥菌中整合子基因研究[J];海洋環(huán)境科學;2008年05期

4 林琳;劉渠;劉衡川;李灶平;白松濤;張茂棠;林少杰;;食品中沙門菌整合子與耐藥性關系[J];中國公共衛(wèi)生;2006年02期

5 林琳,劉渠,劉衡川,李灶平,白松濤,林斯星,張茂棠,林少杰;食品中沙門菌整合子與耐藥性關系研究[J];現(xiàn)代預防醫(yī)學;2005年07期

6 申進玲;楊保偉;席美麗;孟江洪;;陜西省部分地區(qū)零售肉中沙門氏菌和奇異變形桿菌Ⅰ類整合子檢測與耐藥分析[J];食品科學;2011年09期

7 常彥磊;石磊;;沙門氏菌一類基因島研究進展[J];現(xiàn)代食品科技;2008年09期

8 張力燁;朱晨光;張曉君;趙立平;;焦化廢水生物膜樣品和苯酚降解菌分離株基因盒的分析[J];應用與環(huán)境生物學報;2008年05期

9 頓博影;曾冰冰;閆鶴;石磊;;第一類整合酶表達載體的構建及鑒定[J];現(xiàn)代食品科技;2008年01期

10 狄慧玲;石磊;;食源性沙門氏菌Sau-PCR基因分型研究[J];食品與機械;2008年03期

相關會議論文 前10條

1 吳秀萍;魏取好;胡慶豐;呂火祥;周永列;;耐碳青霉烯酶類肺炎克雷伯菌中整合子及整合子相關基因盒的分布[A];2011年浙江省檢驗醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2011年

2 李超;周鐵麗;劉慶中;李向陽;;細菌的整合子及其介導的耐藥研究進展[A];2006年浙江省檢驗醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2006年

3 顧劍;;細菌耐藥性播散機制——整合子-基因盒系統(tǒng)[A];湖北省微生物學會第十屆理事會分析微生物專業(yè)委員會第四次學術會議論文匯編[C];2006年

4 陳丹華;張如霖;丁星;李莉;;整合子耐藥機制的動態(tài)監(jiān)測報道[A];中華醫(yī)學會第八次全國檢驗醫(yī)學學術會議暨中華醫(yī)學會檢驗分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

5 姚慧琳;;銅綠假單胞菌中整合子的分布及其可轉移耐藥性研究[A];中華醫(yī)學會第八次全國檢驗醫(yī)學學術會議暨中華醫(yī)學會檢驗分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

6 楊澤華;蔣曉飛;魏取好;呂元;;高濃度抗生素能夠促進整合子內的耐藥性基因盒的重排[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術會議資料匯編[C];2008年

7 潘勁草;孟冬梅;葉榕;汪皓秋;張蔚;劉克洲;;志賀菌流行株Ⅰ類和Ⅱ類整合子的分子流行病學特征及與耐藥性關系的研究[A];第6次全國微生物學與免疫學大會論文摘要匯編[C];2004年

8 宋坤;王娜;姜中其;;豬源正常菌群大腸桿菌整合子—基因盒定位及質粒圖譜分析[A];浙江省生理科學會2008年學術年會論文匯編[C];2008年

9 陳建國;蘇兆亮;許化溪;王勝軍;聞平;虞健人;;dfrA17和aadA5基因盒—一株銅綠假單胞菌中新發(fā)現(xiàn)的整合子耐藥基因攜帶形式[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術會議資料匯編[C];2008年

10 凌華志;;革蘭陰性桿菌中Ⅰ類整合子特征及其菌株間同源相關性分析[A];中華醫(yī)學會第八次全國檢驗醫(yī)學學術會議暨中華醫(yī)學會檢驗分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

相關重要報紙文章 前10條

1 光大證券研究所 劉t@;中國石化 合理估值逾六元[N];中國證券報;2004年

2 林凡 張翔;子公司遭打壓 中石化整合提速[N];經濟觀察報;2005年

3 本報記者　 聶春林;中石化集團整合子上市公司[N];21世紀經濟報道;2006年

4 記者 鮑文娟邋通訊員 帥菲斐;深一醫(yī)生全球率先發(fā)現(xiàn)兩新耐藥基因[N];廣州日報;2007年

5 武漢新蘭德 余凱;本周四大預期解析[N];上海證券報;2006年

6 記者 徐志勇;深圳發(fā)現(xiàn)兩個新型耐藥基因[N];廣東科技報;2007年

7 證券時報記者 張珈;*ST高陶整合子公司股權鋪路重組[N];證券時報;2010年

8 記者 余輝;中石化股改謹小慎微[N];財會信報;2006年

9 記者　曾永聯(lián)　鄧萍 通訊員　曾敬 原貞;中晟東泰(南寧)納米基因生物技術項目奠基[N];廣西日報;2007年

10 記者 孟苗;我省文化產業(yè)建設方興未艾[N];山西日報;2002年

相關博士學位論文 前10條

1 魏取好;細菌整合子捕獲與表達耐藥性基因盒調控機制的研究[D];復旦大學;2010年

2 夏蕊蕊;山東省濟南市區(qū)廢水環(huán)境中整合子細菌篩選及耐藥性機制研究[D];山東大學;2010年

3 李詠梅;腸出血性及產志賀樣毒素大腸埃希菌耐藥機制的研究[D];吉林大學;2004年

4 潘勁草;志賀菌流行株Ⅰ類和Ⅱ類整合子的特征及與耐藥性關系的研究[D];浙江大學;2004年

5 李明成;產志賀毒素大腸埃希菌多重耐藥分子機制的研究[D];吉林大學;2006年

6 朱靜媛;志賀菌屬細菌整合子與多重耐藥性研究[D];鄭州大學;2010年

7 杜向黨;牛源大腸桿菌Ⅰ型整合子的調查及對氟苯尼考耐藥性的研究[D];中國農業(yè)大學;2005年

8 吳聰明;廣東大腸桿菌耐藥性及整合子/基因盒分子流行病學研究[D];華南農業(yè)大學;2003年

9 鄧笑偉;嗜麥芽窄食單胞菌的耐藥性與整合子關系的研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2007年

10 楊澤華;整合子捕獲基因盒效率調控機制研究[D];復旦大學;2008年

相關碩士學位論文 前10條

1 張輝建;畜禽腸道大腸桿菌耐藥性及整合子—基因盒檢測[D];四川農業(yè)大學;2011年

2 陳曉耘;臨床多重耐藥銅綠假單胞菌中VEB-1基因盒結構及其對整合子捕獲頻率影響的研究[D];復旦大學;2010年

3 陳睿佳;喹啉降解反應器菌群內整合子檢測和耐藥性分析[D];上海交通大學;2010年

4 國憲虎;耐藥整合子細菌在水環(huán)境中的散播調查及其多樣性分析[D];山東大學;2011年

5 常彥磊;健康人群攜帶沙門氏菌第一類整合子與基因組島的鑒定及特性分析[D];華南理工大學;2010年

6 陳雅莉;四川省食品動物源性大腸桿菌耐藥性監(jiān)測及整合子—基因盒檢測[D];四川農業(yè)大學;2010年

7 陳體;產超廣譜β-內酰胺酶菌中整合子耐藥機制的研究[D];中南大學;2011年

8 杜江東;嗜麥芽窄食單胞菌整合子分布與多重耐藥的研究[D];青島大學;2012年

9 王鳳平;1800株G-桿菌插入序列共同區(qū)和整合子的耐藥機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

10 趙紅波;健康人攜帶的沙門菌第一類整合子和沙門菌基因組島的鑒定及特性分析[D];河北醫(yī)科大學;2010年

，

本文編號：2590077