【摘要】：近年來,有害藻華的暴發(fā)頻率逐年提高,規(guī)模不斷擴大,已成為世界性的海洋災(zāi)害。目前有害藻華的眾多治理方法中,改性粘土絮凝法被認(rèn)為是最有效的方法之一,多次被應(yīng)用于大規(guī)模有害藻華的現(xiàn)場治理,已經(jīng)成為我國有害藻華應(yīng)急處置的標(biāo)準(zhǔn)方法。在多次現(xiàn)場應(yīng)用中,發(fā)現(xiàn)改性粘土對藻華生物的去除率達到80%時即可控制有害藻華,雖然水體殘留的20%微藻密度依然較高,但未發(fā)現(xiàn)這部分微藻在短期內(nèi)形成二次藻華。為了揭示殘留微藻生長受抑制的機制,本文通過室內(nèi)模擬實驗,以典型有害甲藻強壯前溝藻(Amphidinium carterae Hulburt)和米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)為實驗對象,從生理生化角度入手,考察了不同濃度改性粘土處理后,殘留強壯前溝藻和米氏凱倫藻氧化應(yīng)激系統(tǒng)和光合作用的變化;并利用實時熒光定量PCR方法,進一步研究了殘留米氏凱倫藻的脅迫適應(yīng)和光合作用基因表達的變化。主要成果如下:(1)改性粘土不僅可以有效絮凝沉降強壯前溝藻,而且顯著地抑制該藻的生長和影響其關(guān)鍵生理過程。隨著改性粘土濃度的增大,對強壯前溝藻的去除率增大;當(dāng)改性粘土濃度≥0.10 g/L時,殘留微藻的生長受到顯著抑制。經(jīng)過改性粘土處理后,殘留微藻的丙二醛(MDA)含量上升,說明其細(xì)胞內(nèi)積累了大量活性氧(ROS)。實驗組殘留微藻的細(xì)胞密度與超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、MDA含量均呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)性,因此推測細(xì)胞內(nèi)過度積累的ROS可能是抑制殘留微藻生長的主要內(nèi)在因素。此外,研究發(fā)現(xiàn)殘留微藻的光合色素含量和凈光合作用速率下降,表明改性粘土對殘留強壯前溝藻的光合作用產(chǎn)生了嚴(yán)重傷害。葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),單位面積上反應(yīng)中心RC/CS_0顯著下降,表明光合系統(tǒng)II(PSII)反應(yīng)中心部分失去活性,引起剩余有活性的反應(yīng)中心過度激發(fā),即單位反應(yīng)中心吸收的能量(ABS/RC)、捕獲的能量(TR_0/RC)和用于電子傳遞的能量(ET_0/RC)上升。但是TR_0/ABS和ET_0/ABS下降,表明殘留微藻的光能吸收和利用失去平衡。此外,0.25 g/L改性粘土處理3 h時,殘留微藻W_K和V_J分別上升為對照組的1.24和1.20倍,表明其放氧復(fù)合體受到破壞,初級醌受體Q_A至次級醌受體Q_B的電子傳遞鏈?zhǔn)茏�。改性粘土對殘留微藻光合作用的以上影�?導(dǎo)致了葉綠體ROS的大量積累。(2)選取我國近海第二有害藻華優(yōu)勢種米氏凱倫藻為實驗對象,開展了不同濃度改性粘土對其生長的影響研究。在實驗條件下,加入0.50 g/L改性粘土,米氏凱倫藻的去除率可達到64%,并且殘留微藻的生長受到了顯著抑制。各實驗組殘留米氏凱倫藻的過氧化氫(H_2O_2)和MDA含量顯著提高,表明改性粘土導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積累較多的ROS,并引起氧化壓力。細(xì)胞內(nèi)H_2O_2濃度與微藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān),進一步驗證了細(xì)胞內(nèi)過多ROS會抑制其生長的推論。從光合作用角度,雖然殘留米氏凱倫藻的實際光化學(xué)效率未受影響,即光反應(yīng)能夠產(chǎn)生足夠的NADPH和電化學(xué)勢,但殘留微藻的最大光化學(xué)效率F_v/F_m和光合性能指數(shù)PI_(ABS)下降,表明改性粘土對其光合作用產(chǎn)生脅迫傷害。具體來講,殘留微藻的光能吸收和利用失衡,電子傳遞受阻,Q_A~-過度積累,可能導(dǎo)致單線氧~1O_2的產(chǎn)生。(3)使用實時熒光定量PCR方法,篩選了改性粘土處理條件下,米氏凱倫藻的內(nèi)參基因為β-actin。定量分析了殘留米氏凱倫藻的脅迫適應(yīng)和光合作用相關(guān)基因表達,初步從基因水平闡釋了改性粘土對殘留微藻生理活動的影響。0.50 g/L改性粘土處理后,殘留微藻的熱休克蛋白90(HSP90)和HSP70快速參與到細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)中,是抗逆過程的重要承擔(dān)者。兩者的編碼基因(hsp90和dnaK)與大多數(shù)光合作用基因的表達變化呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性,表明兩者可能參與了殘留微藻光合作用的修復(fù)過程。改性粘土顯著抑制了殘留米氏凱倫藻光合作用的關(guān)鍵蛋白基因(psbC、psbB、psbA、psbD、psa B和psaA)的表達,PSII和PSI雖然受到一定程度的影響,但實際光化學(xué)效率未受影響,并經(jīng)過細(xì)胞的信號傳導(dǎo)調(diào)控,在2 d時各蛋白表達量均有不同程度的恢復(fù)。殘留微藻ATP合成酶的編碼基因表達量顯著降低,而且保持該水平至實驗后期,表明微藻對光反應(yīng)提供的跨膜質(zhì)子梯度利用率可能下降,合成ATP的過程受到破壞。實驗組微藻核酮糖-1.5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)的大亞基編碼基因rbcL表達雖然在實驗前期顯著下降,但在2 d時恢復(fù)至與對照無顯著差別的水平,推測Rubisco蛋白含量可能不是光合作用的限制因素;根據(jù)CbbX(Rubisco活化酶)和ATP合成酶編碼基因表達量的變化,推測Rubisco的活性可能降低,直接影響了CO_2固定效率,引起ROS的大量積累,從而影響其正常生長。綜上所述,本文從生理生化角度研究了改性粘土對殘留微藻生長的影響,為改性粘土除藻機制提供補充。結(jié)果表明,改性粘土影響殘留微藻的氧化應(yīng)激系統(tǒng),引起細(xì)胞內(nèi)過度積累ROS,形成的氧化脅迫是抑制其生長的主要內(nèi)在因素。改性粘土對殘留微藻的光合作用也產(chǎn)生較大影響,破壞光合機構(gòu),光能吸收與利用失去平衡,電子傳遞受阻,可能導(dǎo)致葉綠體ROS的形成。此外初步研究了殘留微藻光合作用相關(guān)基因的表達變化,進一步從分子水平上解釋了其光合生理的變化。
【圖文】：

葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線。（A）橫坐標(biāo)為時間；（B）橫坐標(biāo)為時（上圖的 I 點相當(dāng)于下圖中的 J 點）（Govindjee，1995）.1 Atypical chlorophyll a fluorescence transient. (A) Time scale was pl; (B) Time scale was plotted on a logarithmic time scale (Govindjee，1991.A 的 O-I-D-P 曲線的時間橫坐標(biāo)軸進行轉(zhuǎn)換成對數(shù)時間作圖熒光誘導(dǎo)動力學(xué)曲線 O-J-I-P 相（Govindjee，1995；Strasser 1.1.B 所示。具體來講，，在 O 點時植物葉片和藻類經(jīng)過充分電子受體：初級醌受體（TheprimaryquinoneelectronacceptoThesecondaryquinoneelectronacceptor，QB）和質(zhì)體醌（Plasto氧化狀態(tài)，接受電子的能力最大，PSII 反應(yīng)中心處于完全開復(fù)光照發(fā)射出的熒光值最小。當(dāng)激發(fā)的 PSII 將電子從 P680

度的增大屬于熱力學(xué)階段。飽和光 PSII 反應(yīng)中心完全關(guān)閉，熒光強度曲線包含大量信息，可以反映不同李鵬民 等，2005）�；A(chǔ)上，建立起來高度簡化的衡量 1.2 所示。根據(jù)該模型，天線色素（ptionflux，ABS）后，如前文所述，式耗散掉小部分，其他主要部分被rappingflux，TR），反應(yīng)中心將這部進行電子傳遞（Electron transport fl的數(shù)據(jù)分析方法——JIP-test，為我，已經(jīng)成為該領(lǐng)域重要的研究工具（7）。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X52

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本文編號：2589857