【摘要】： 近年來,對環(huán)境化學(xué)物毒性危害的研究已由原來單一因素為主向因素間聯(lián)合作用方向發(fā)展。鉛、鎘均是生產(chǎn)和生活中接觸頻率大、暴露范圍廣的蓄積性毒物,能對發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響。鉛、鎘單獨(dú)作用的報(bào)道較多,而對兩者的聯(lián)合毒性研究則相對較少,尤其是鉛鎘聯(lián)合對處于發(fā)育早期的動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷的系統(tǒng)研究較為罕見。本研究選用新生大鼠作為試驗(yàn)動物,通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法較系統(tǒng)的探討了鉛、鎘及其聯(lián)合對新生大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損傷效應(yīng)及其可能的作用機(jī)理,為進(jìn)一步認(rèn)識鉛、鎘及其聯(lián)合毒性作用提供理論依據(jù)。 一、體外試驗(yàn)選用新生24h內(nèi)SD大鼠作為試驗(yàn)用神經(jīng)細(xì)胞的來源,采用尼氏染色對皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)鑒定和純度分析,用CCK-8法檢測了一個(gè)生長周期內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的活性分布,成功建立了大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的體外培養(yǎng)模型:在此基礎(chǔ)上,在培養(yǎng)液中添加不同濃度的Pb、Cd,共分9組,分別為對照組、P_1(Pb100μmol/L)、P_2(Pb 200μmol/L)、C_1(Cd 5μmol/L)、C_2(Cd 10μmol/L)、P_1C_1(Pb100μmol/L+Cd 5μmol/L)、P_1C_2(Pb 100μmol/L+Cd 10μmol/L)、P_2C_1(Pb 200μmol/L+Cd 5μmol/L)、P_2C_2(Pb 200μmol/L+Cd 10μmol/L)組。分別從神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、神經(jīng)細(xì)胞存活率、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率以及神經(jīng)細(xì)胞GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性和MDA含量等方面對鉛、鎘損傷新生大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了研究;同時(shí),添加N-乙酰半胱氨酸(NAC),觀察其在鉛鎘損傷神經(jīng)細(xì)胞過程中的保護(hù)效果。結(jié)果表明,①本試驗(yàn)培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞,經(jīng)尼氏染色鑒定并計(jì)數(shù)神經(jīng)細(xì)胞純度在92%以上,且在一個(gè)生長周期內(nèi)培養(yǎng)至第6d時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的OD值最高,因此,本試驗(yàn)將第6d確定為鉛鎘處理神經(jīng)細(xì)胞的時(shí)間;②與對照組相比,鉛、鎘及其聯(lián)合均能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、網(wǎng)絡(luò)減少或消失;能使胞體短直徑和突起長度顯著變小和縮短(P＜0.05);使神經(jīng)細(xì)胞的存活率顯著下降(P＜0.05),且具有明顯的時(shí)間與劑量效應(yīng);各染毒組神經(jīng)細(xì)胞核皺縮、呈新月形、染色質(zhì)致密濃染,甚至出現(xiàn)核碎裂,細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05);與相應(yīng)單獨(dú)染毒組比較,各聯(lián)合染毒組上述指標(biāo)變化更為嚴(yán)重,P_1C_2組較P_2C_1組改變明顯,其中以P_2C_2組最為顯著(P＜0.05);③與對照組比較,各染毒組神經(jīng)細(xì)胞GSH-Px、SOD、TChE活性均顯著下降(P＜0.05),而CAT活性和MDA含量則顯著升高(P＜0.05);④在NAC拮抗鉛、鎘及其聯(lián)合毒性試驗(yàn)中,可以看出NAC能使神經(jīng)細(xì)胞存活率升高、細(xì)胞凋亡率下降,能使GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性升高及MDA含量下降,但無顯著性差異(P＞0.05)。由上述試驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論:①鉛、鎘及其聯(lián)合能使神經(jīng)細(xì)胞胞體變小,神經(jīng)細(xì)胞突起變短,神經(jīng)細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)連接減少;能使神經(jīng)細(xì)胞存活率下降,神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加,且具有明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)。鉛鎘聯(lián)合表現(xiàn)協(xié)同毒性效應(yīng),其中鎘在聯(lián)合作用中發(fā)揮主導(dǎo)作用;②鉛、鎘及其聯(lián)合能顯著改變神經(jīng)細(xì)胞GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性和MDA含量,因此,鉛、鎘的神經(jīng)系統(tǒng)毒性與其脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān);③添加NAC可以提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率,減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量,增加GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性,減少M(fèi)DA的生成,說明NAC具有一定的拮抗鉛、鎘毒性損傷的作用,但保護(hù)效果不明顯。 二、體內(nèi)試驗(yàn)35只懷孕母鼠被隨機(jī)分為7組,分別為對照組(飲用蒸餾水)、鉛組(300mg/L)、鉛+NAC組(300mg/L+20mmol/L)、鎘組(10mg/L)、鎘+NAC組(10mg/L+20mmol/L)、鉛鎘聯(lián)合組(300mg/L+10mg/L)、鉛鎘聯(lián)合+NAC組(300mg/L+10mg/L+20mmol/L)。經(jīng)飲水染毒,染毒時(shí)間為整個(gè)妊娠期,待分娩后觀察并記錄:①鉛、鎘及其聯(lián)合對新生鼠生長發(fā)育的影響;②用光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察新生鼠大腦皮質(zhì)組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化;③測定新生鼠腦組織GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性及MDA含量;④ICP-MS檢測了新生鼠體內(nèi)主要微量元素Cu、Fe、Zn、Mn及Se含量;⑤FQ-PCR法檢測了凋亡基因bcl-2、Bax和c-fos在新生鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá);免疫組織化學(xué)和FQ-PCR法檢測了MT-3在新生鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá)研究;⑥同時(shí)進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的NAC保護(hù)試驗(yàn)研究。結(jié)果表明,①與對照組比較,各染毒組新生鼠體重和腦重均明顯下降(P＜0.05或P＞0.05),其中以鉛鎘聯(lián)合組降低最為明顯;②新生鼠大腦皮質(zhì)組織經(jīng)HE染色未見明顯異常的病理組織學(xué)變化,但超微結(jié)構(gòu)變化明顯,表現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞核固縮、變形,染色質(zhì)邊聚、輕度溶解,線粒體腫脹、嵴部分或完全消失,鉛鎘聯(lián)合對新生鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的損傷較鉛、鎘單獨(dú)時(shí)嚴(yán)重;③各染毒組新生鼠體內(nèi)微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量均顯著低于對照組(P＜0.05),以鉛鎘聯(lián)合組降低最為明顯;④與對照組相比,鉛、鎘及其聯(lián)合均使新生鼠腦組織GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性下降及MDA含量升高(P＜0.05或P＞0.05);⑤各染毒組新生鼠大腦皮質(zhì)bcl-2基因的表達(dá)均低于對照組(P＜0.05或P＞0.05),而Bax、c-fos和MT-3表達(dá)則顯著高于對照組(P＜0.05);⑥NAC保護(hù)組與相應(yīng)染毒組比較,新生鼠體內(nèi)微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量均有所升高(P＜0.05或P＞0.05),腦組織GSH-Px、SOD、TChE、CAT活性均有不同程度升高但差異不顯著(P＞0.05),MDA含量則顯著下降(P＜0.05),大腦皮質(zhì)bcl-2基因的表達(dá)量明顯增加(P＜0.05或P＞0.05),而Bax和c-fos表達(dá)則顯著減少(P＜0.05)。通過對本部分試驗(yàn)結(jié)果的分析,可得出以下結(jié)論:①母鼠妊娠期鉛、鎘及其聯(lián)合暴露能明顯減輕新生鼠體重和腦重,導(dǎo)致新生鼠腦發(fā)育遲緩;②母鼠妊娠期鉛、鎘及其聯(lián)合暴露對新生鼠大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)有顯著影響,導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞核固縮、變形,線粒體腫脹、嵴部分或完全消失;③鉛、鎘及其聯(lián)合導(dǎo)致機(jī)體抗氧化酶活性降低可能與其微量元素Cu、Fe、Zn、Mn和Se含量下降有關(guān);④鉛、鎘及其聯(lián)合誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與bcl-2、Bax、c-fos基因的異常表達(dá)有關(guān),鉛鎘聯(lián)合表現(xiàn)協(xié)同毒性效應(yīng);⑤母鼠妊娠期鉛、鎘及其聯(lián)合暴露的同時(shí)添加NAC可以提高新生鼠體重和腦重,新生鼠體內(nèi)微量元素的含量增加,使新生鼠腦組織內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT、TChE活性升高,MDA含量顯著降低,能增加bcl-2的表達(dá)量、減少Bax、c-fos和MT-3的表達(dá)量,表明NAC對鉛、鎘毒性損傷具有一定的保護(hù)作用。
【圖文】：
揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文鉛在巖石圈、水圈、大氣圈、生物圈和土壤圈之間進(jìn)行地球化學(xué)循環(huán)(如圖1一1)。在地殼中Pb是重金屬中含量最多的元素，總量為lo14T，平均含量為16ppm，各類巖石中含Pb量有一定的差異，以花崗巖(24ppm)、片巖(20即m)、頁巖(20ppm)含Pb量較高。土壤中Pb的來源是多方面的，首先是形成土壤的母質(zhì)本身就含Pb，土壤中原有存在的Pb，來自放風(fēng)化巖中的礦物，例如方鉛礦 (Pbs)
哺乳動物的MT分子量在6一7kd之間，其空間結(jié)構(gòu)由a和p兩個(gè)大小相當(dāng)(直徑15一2腸)、近似球形的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，2個(gè)結(jié)構(gòu)域通過第30、31位的賴氨酸殘基(切s一切s)相連，，因此整個(gè)分子呈啞鈴型(見圖1一2)。圖1一2金屬硫蛋白(MT)的空間結(jié)構(gòu) Figurel一 2SPatialstruetureofmetallotllionein(MT)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：X174
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本文編號：
2587702
