【摘要】：微囊藻毒素(microcystins,MCs)是由藍(lán)藻產(chǎn)生,廣泛存在于淡水中具有五肽或者七肽相關(guān)結(jié)構(gòu)、具有肝毒性和其他毒性的一類毒素。MCs在魚類和貝類等產(chǎn)品中富集,通過食物鏈和飲用水進(jìn)入人體內(nèi)。MCs具有多種異構(gòu)體,微囊藻毒素-LR(MC-LR)是其中毒性最強(qiáng),分布最廣泛的一種,對人類身體健康和食品安全造成了嚴(yán)重的威脅。關(guān)于MC-LR的檢測方法包括生物檢測法,儀器檢測法與免疫學(xué)檢測法等。免疫學(xué)檢測主要是基于抗原抗體之間的特異性反應(yīng)原理而建立,其中,ELSIA檢測法具備迅速、簡便、靈敏并且適合大量樣品檢測等優(yōu)點(diǎn);膠體金免疫層析試紙條具有快速、操作簡單、直觀等特點(diǎn)適合現(xiàn)場的初步檢測,免疫學(xué)快速檢測方法在MC-LR檢測中逐漸被重視。本研究基于抗原抗體之間的特異性反應(yīng),制備了檢測抗原作為固相包被抗原,并且同時將包被抗原與羧基磁珠偶聯(lián)制備磁珠探針,利用膠體金標(biāo)記MC-LR單克隆抗體獲得金標(biāo)探針,分別建立了間接競爭ELSIA(ic-ELSIA)檢測方法、基于納米磁珠的MC-LR間接競爭ELSIA(IMB-ic-ELSIA)檢測方法和膠體金免疫層析試紙條檢測方法實(shí)現(xiàn)水環(huán)境中MC-LR的檢測。利用“碳二亞胺法”將小分子MC-LR與載體蛋白-牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備固相包被抗原(MC-LR-BSA),利用檢測物中的游離靶標(biāo)與微孔板中固相抗原競爭特異性單克隆抗體的方式建立間接競爭性ELISA(ic-ESLIA),對ic-ESLIA方法檢測的主要條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化之后的主要參數(shù)為:檢測原包被濃度為2μg/m L,包被時間為4℃,12 h;封閉劑為脫脂奶粉,37℃孵育2 h;單抗最佳稀釋倍數(shù)為1:30 000,37℃孵育1 h;二抗稀釋倍數(shù)為1:4 000,37℃孵育1 h;TMB底物顯色液37℃孵育10 min。MC-LR的線性回歸方程為:y=0.4485x+0.1014,相關(guān)系數(shù)R2=0.9908,檢測方法對MC-LR的檢測范圍是0.99ng/m L-60.34 ng/m L,IC50=7.74 ng/m L;模擬實(shí)際樣品分別添加濃度為40 ng/m L、20 ng/m L、10 ng/m L、5 ng/m L的標(biāo)準(zhǔn)品,對應(yīng)的回收率分別為90.78%、88.90%、87.10%、88.00%,平均回收率為88.70%;分別采集了長春市內(nèi)南湖水、凈月潭水、北湖水、伊通河水和自來水進(jìn)行檢測,未檢出MC-LR;檢測模擬樣品,檢測出相應(yīng)含量的MC-LR。將包被抗原與羧基磁珠偶聯(lián)制備磁珠探針,作為固相載體,通過抗原競爭的方式在磁場的作用下,建立IMB-ic-ELSIA檢測方法,并對主要條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化之后的主要參數(shù)為:磁珠探針用量為40μg,單抗最佳稀釋倍數(shù)為1:8 000,37℃孵育10 min;二抗稀釋倍數(shù)為1:3 000,37℃孵育20 min;TMB底物顯色液37℃孵育8 min。MC-LR的線性回歸方程為:y=0.4303x+0.0248,相關(guān)系數(shù)R2=0.9904,檢測方法對MC-LR的檢測范圍是1.50ng/m L-107.15 ng/m L,IC50=12.59 ng/m L;模擬實(shí)際樣品添加濃度為100 ng/m L、60 ng/m L、20 ng/m L、5 ng/m L的標(biāo)準(zhǔn)品,檢測對應(yīng)的回收率分別為84.72%、91.38%、82.20%、105.80%,平均回收率為91.02%;分別采集了長春市內(nèi)南湖水、凈月潭水、北湖水、伊通河水和自來水進(jìn)行檢測。未檢出MC-LR;檢測模擬樣品,檢測出相應(yīng)含量的MC-LR。采用經(jīng)典法檸檬酸鈉還原法制備了直徑約為20 nm膠體金溶液,與MC-LR單克隆抗體共同孵育制備金標(biāo)探針,以偶聯(lián)抗原作為檢測線,抗鼠二抗作為質(zhì)控線,利用待檢物中的游離靶標(biāo)與NC膜上的固相抗原競爭膠體金探針的方式建立膠體金免疫層析試紙條檢測方法,,并優(yōu)化主要反應(yīng)條件。優(yōu)化后的主要參數(shù)為:100μL的膠體金溶液加入0.9μL 0.2mol/m L K2CO3溶液,加入單抗量為1μg;抗原工作濃度為4 mg/m L;二抗?jié)舛葹?.3 mg/m L;抗原固定液為0.01 mol/m L PBS;NC膜采用sartorius 140;試紙條檢測限為60 ng/m L。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：X832

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2324665