本文關鍵詞：核受體介導的農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的內(nèi)分泌干擾效應研究　出處：《浙江工業(yè)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：我國是世界上農(nóng)藥生產(chǎn)和使用量最大的國家,農(nóng)藥的生態(tài)安全和健康風險一直是備受關注的研究熱點。現(xiàn)有研究表明農(nóng)藥可以通過多種途徑進入生態(tài)系統(tǒng),在不同的環(huán)境介質中會形成數(shù)量眾多、結構多樣的中間代謝產(chǎn)物。但是農(nóng)藥中間代謝產(chǎn)物的風險還是農(nóng)藥風險評估和管理的一個盲點。內(nèi)分泌干擾效應是研究最為廣泛的污染物生態(tài)安全指標,但關于農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的內(nèi)分泌干擾效應的依舊十分缺失。本研究首先通過對斑馬魚胚胎毒性實驗、細胞毒性實驗研究了農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的毒性效應,其次利用多種核受體介導雙熒光報告基因系統(tǒng)、H295R體外模型及計算機輔助技術研究了由多種核受體介導的農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物內(nèi)分泌干擾效應。本研究的主要工作和研究成果分為一下兩大部分:(1)百菌清在斑馬魚體內(nèi)代謝產(chǎn)物的檢測及環(huán)境相關濃度下它們的胚胎毒性與內(nèi)分泌干擾效應的研究。百菌清是一種年使用量十分巨大且環(huán)境殘留較高的廣譜殺菌劑。雖然使用量非常巨大,但是關于百菌清尤其是它的代謝產(chǎn)物對水生生物的潛在生態(tài)風險效應的研究仍然十分有限。在本實驗中,我們選取了斑馬魚作為一種水生生物的體內(nèi)模型,利用Q-TOF技術首次鑒定到了百菌清在斑馬魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物——4-羥基百菌清;同時我還利用PCR方法探索了百菌清由肝臟細胞色素P450介導的生物轉化機制。之后,我們利用體內(nèi)體外模型全面地評估了百菌清及4-羥基百菌清的胚胎發(fā)育毒性及潛在的內(nèi)分泌干擾效應。胚胎毒性的實驗結果表明暴露96小時后,百菌清及4-羥基百菌清導致斑馬魚胚胎死亡的最低可見效應濃度均為50?g/L。在相同的50?g/L的濃度下,4-羥基百菌清對斑馬魚胚胎致死效應大約為百菌清的2.6倍。雙熒光報告基因實驗的結果表明百菌清和4-羥基百菌清都具有雌激素激動效應,其REC20值分別為2.4×10-8 M和3.6×10-8 M。但是,在甲狀腺激素干擾效應方面,這樣4-羥基百菌清即表現(xiàn)出了甲狀腺激素激動效應又表現(xiàn)出了甲狀腺激素拮抗效應。最后,我們利用分子對接技術來預測百菌清及4-羥基百菌清與雌激素受體和甲狀腺激素受體作用強弱。對接的結果與雙熒光報告基因實驗的結果保持一致�？偟膩碚f,我們的研究表明4-羥基百菌清表現(xiàn)出了比母本化合物更強的內(nèi)分泌干擾效應。實驗結果提醒我們要更加關注對殺菌劑及其代謝產(chǎn)物潛在的生態(tài)健康風險的評價。(2)糖皮質激素受體和鹽皮質激素受體介導的4種農(nóng)藥及其21種代謝產(chǎn)物的內(nèi)分泌干擾效應的研究。吡丙醚、馬拉硫磷、苯霜靈和惡唑禾草靈是四種目前仍在廣泛使用的農(nóng)藥。由于其使用量大,在環(huán)境中會降解產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,因此對這些農(nóng)藥以及它們代謝產(chǎn)物的生態(tài)健康風險效應評價具有重要的意義。在本實驗中,我們以CHO-K1細胞系為模型,利用MTS法對比4種農(nóng)藥及其21種代謝產(chǎn)物的毒性效應;以雙熒光報告基因系統(tǒng)來評價這些化合物由糖皮質激素受體和鹽皮質激素受體介導的內(nèi)分泌干擾效應。分子對接作為一種強大的工具被成功用于揭示目標化合物與糖皮質激素受體和鹽皮質激素受體的識別位點相互作用的具體信息。另外,我們還采用PCR和激素測定這兩個分析方法來全面地揭示目標化合物對H295R細胞內(nèi)基因表達和激素分泌的影響并在原子水平模擬目標化合物與受體之間的相互作用情況。MTS實驗的結果表明Pry-A,Pry-C,Pry-D,Pry-H,ML-A和BX-B均會對CHO-K1細胞產(chǎn)生細胞毒性,且ML-A的毒性最強,在10-8 M濃度下還能顯著影響細胞活性。雙熒光報告基因實驗的結果顯示,在檢測的25種化合物中,僅Pry-F,Pry-G,ML,ML-A表現(xiàn)出了糖皮質激素拮抗效應。這四種化合物GR拮抗效應的強弱順序為ML-APry-FPry-GML,其RIC20值分別為10-10 M,3.1×10-8 M,1.6×10-6 M和7.2×10-6 M。分子對接的結果也基本印證了雙熒光報告基因的結果。PCR的實驗結果顯示,Pry-F,Pry-G,ML,ML-A的暴露會顯著影響類固醇類激素合成轉運相關的基因的表達,低濃度暴露下,3?HSD2,CYP11B1,CYP11B2等基因的表達量出現(xiàn)顯著的上調(diào)。實驗得到的數(shù)據(jù)將有助于我們更好的了解農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物可能造成的潛在生態(tài)健康風險。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X592;X171.5

【參考文獻】

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本文編號：1350214