發(fā)布時間：2018-03-02 15:34

  本文選題：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎　切入點：DNA甲基化　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種難治性疾病,在我國患病率約為0.3%,是一種全身性自身免疫性疾病,以非化膿性、增生性滑膜炎病變?yōu)橹?逐漸導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞,最后造成關(guān)節(jié)功能的障礙及多器官、多組織受累。目前,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因尚未闡明。許多研究認(rèn)為,遺傳和環(huán)境因素是主要的病因。現(xiàn)有研究表明,RA患者普遍存在基因組DNA低甲基化,而基因組DNA低甲基化可能使RA患者的某些基因的表達異常,此種機制可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 真核基因表達的調(diào)控發(fā)生于多階段水平,即基因組、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后等5個階段水平。精確調(diào)控機制之一是DNA甲基化。這是一種從遺傳過程中獲得的使DNA發(fā)生化學(xué)變化的漸進性調(diào)控過程,DNA甲基化發(fā)生在DNA復(fù)制之后,轉(zhuǎn)錄之前。其基本過程是在DNA甲基化酶的催化下,從S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上轉(zhuǎn)移甲基到胞嘧啶環(huán)的第5位碳原子(或腺嘌呤環(huán)的N6位)上(生成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤),從而得到甲基化DNA。DNA甲基化與抗核酶的抗性、細(xì)胞防御機制、基因激活與印記、細(xì)胞的分化與發(fā)育,以及衰老和癌變相關(guān)。 DNA錯配修復(fù)(mismatch repair, MMR)是重要的突變避免系統(tǒng),它通過校正正常DNA代謝中產(chǎn)生的堿基錯配及調(diào)節(jié)DNA損傷所誘導(dǎo)的凋亡來維持基因組的穩(wěn)定性。錯配修復(fù)為細(xì)胞準(zhǔn)確復(fù)制和增殖所必須,若錯配修復(fù)系統(tǒng)異常,細(xì)胞突變頻率可增加100倍以上。人體細(xì)胞中DNA錯配修復(fù)反應(yīng)過程依賴于幾種人類MMR基因產(chǎn)物的參與,因此,其中任何一種基因發(fā)生突變導(dǎo)致其產(chǎn)物功能的喪失都將造成DNA錯配修復(fù)功能的異常、缺陷或喪失。 目前人類的錯配修復(fù)(mismatch repair enzyme,MM -R)系統(tǒng)含有9個基因:hMLH1、hMLH3、hPMS1、hPMS2、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6,其中hMLH1(human mut-l homologue1,hMLH1)是人類錯配修復(fù)系統(tǒng)中功能最重要的一個基因,主要作用是保持遺傳物質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性,保證DNA復(fù)制的忠實性。如果這些錯配修復(fù)基因功能發(fā)生缺陷或活性降低,復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯誤不能及時被糾正,就會導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatellite instability,MSI)的出現(xiàn),使整個基因組不穩(wěn)定,隨機突變率增高,從而引起疾病的發(fā)生。 有研究顯示,hMLH1表達的缺失與此基因啟動子胞嘧啶甲基化直接有關(guān)。在Leung等的研究中,90 %以上發(fā)生hMLH1甲基化的散發(fā)性胃癌病例同時伴有hMLH1蛋白的表達缺失,提示甲基化是導(dǎo)致hMLH1基因轉(zhuǎn)錄靜止的原因。hMLH1啟動子甲基化是hMLH1失活的早期分子活動,可導(dǎo)致mRNA或蛋白表達降低,影響hMLH1修復(fù)功能的正常發(fā)揮,使相關(guān)基因突變不能及時有效糾正,最終促使疾病發(fā)生。然而,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者h(yuǎn)MLH1啟動子CpG島甲基化狀態(tài)如何,國內(nèi)外尚未見報道。本實驗以人外周靜脈血為研究對象,研究hMLH1基因在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的甲基化情況,并在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平觀察該基因的表達情況。目前,DNA甲基化也是法醫(yī)學(xué)的研究熱點。本實驗又結(jié)合DNA甲基化自身的特點,探討其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。 方法:采取RA患者外周靜脈血,密度梯度離心法分離出外周血單個核細(xì)胞,提取RNA;全血提取DNA及核蛋白。 RT-PCR、Western Blot方法檢測外周血hMLH1 mRNA及蛋白表達。所得結(jié)果用Gel-pro凝膠分析軟件進行半定量分析。采用亞硫酸氫鈉(Sodium Bisulfite)方法處理基因組DNA,甲基化特異性PCR(methylation - specific PCR ,MSP)方法檢測hMLH1基因啟動子甲基化情況。實驗分為兩組:健康人對照組和RA患者組。SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件進行分析,行χ2檢驗或Fisher’-s確切概率法檢驗和Spearman等級相關(guān)分析,均數(shù)的比較行秩和檢驗。 結(jié)果:1 38例健康人外周血hMLH1 mRNA均有表達,而33例RA患者外周血有17例hMLH1 mRNA是不表達的;38例健康人外周血hMLH1蛋白均有表達,而33例RA患者外周血有22例hMLH1蛋白是不表達的;經(jīng)秩和檢驗,RA患者外周血hMLH1 mRNA、蛋白陽性率明顯低于健康人(P 0.05)。 2 RA患者組與健康人對照組外周血hMLH1甲基化陽性率分別為90.9%(30/33)和13.2%(5/38),兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=42.717,P 0.05)。 3本研究發(fā)現(xiàn),30例hMLH1啟動子甲基化陽性的RA患者中,有14例mRNA表達陰性;而15例hMLH1 mRNA表達陰性的RA患者中,有14例hMLH1啟動子甲基化陽性。30例hMLH1啟動子甲基化陽性的RA患者中,有20例蛋白表達陰性;而21例hMLH1蛋白表達陰性的RA患者中,有20例hMLH1啟動子甲基化陽性。Western Blot方法檢測hMLH1蛋白表達變化與其mRNA表達情況一致。用Spearson等級相關(guān)檢驗對二者進行相關(guān)分析,結(jié)果hMLH1 mRNA、蛋白表達與hMLH1啟動子甲基化呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.866, P0.01)(r=-0.541, P0.01)。 4 hMLH1啟動子甲基化、mRNA及蛋白表達在RA患者不同年齡、性別、RF、ESR、CRP等指標(biāo)的分布無顯著意義(P㧐0.05),即還不能認(rèn)為hMLH1啟動子甲基化,mRNA及蛋白表達水平與RA患者不同年齡、性別、RF、ESR、CRP等指標(biāo)有相關(guān)關(guān)系。 5 DNA甲基化圖譜有巨大的信息容量和廣泛的適用性。借助發(fā)育、衰老、腫瘤,以及其它領(lǐng)域的甲基化標(biāo)記研究成果,可能在親子鑒定和個體識別上大有作為,為解決一系列法醫(yī)學(xué)問題提供一條全新的途徑。 結(jié)論:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血hMLH1啟動子呈異常超甲基化狀態(tài)。這種異常超甲基化影響了hMLH1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,可能參與了RA疾病的發(fā)生發(fā)展。 DNA甲基化圖譜有巨大的信息容量和廣泛的適用性。借助發(fā)育、衰老、腫瘤,以及其它領(lǐng)域的甲基化標(biāo)記研究成果,可能在親子鑒定和個體識別上大有作為,為解決一系列法醫(yī)學(xué)問題提供一條全新的途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：D919

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