采用Piscidin基因串聯(lián)表達的方案,通過Eco31Ⅰ限制性內(nèi)切酶定向連接方法合成Pseudosciaena crocea-Sciaenops ocellatus-piscidin (PSP)串聯(lián)基因.以畢赤酵母(Pichia pastoris)的穿梭表達載體pPICZαA構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPICZαA-PSP,轉(zhuǎn)化入畢赤酵母SMD1168菌株中.應(yīng)用實時熒光定量PCR方法進行多拷貝克隆篩選,實現(xiàn)了PSP重組串聯(lián)肽的誘導(dǎo)表達和純化,并對其抑菌活性進行初步鑒定,為piscidin抗菌肽的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

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【部分圖文】：

圖1 PSP串聯(lián)基因設(shè)計

P.crocea-S.ocellatus-piscidin(PSP）串聯(lián)基因設(shè)計如圖1所示：由2個PC-piscidin基因、2個SO-piscidin基因和3個連接肽基因（linkergene，序列為5′-GGTTCTCCAGGTTCCGGT-3′）組成；串聯(lián)基因3′-端添加....

圖2 pPICZαA-PSP質(zhì)粒PCR檢測（a）與雙酶切驗證（b)

使用5′-AOX和3′-AOX引物對重組質(zhì)粒進行PCR檢測，獲得約800bp的目的擴增條帶（圖2(a））；再使用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切處理pPICZαA-PSP質(zhì)粒，如圖2(b）所示，可得358bp的目的片段與3500bp的載體條帶，證實插入表達載體的片段與設(shè)計合成基因一致．....

圖3 陽性克隆篩選

pPICZαA-PSP及pPICZαA質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ線性化后，電轉(zhuǎn)化入SMD1168菌株，使用5′-AOX、3′-AOX、PC1、SO8引物交替組合進行PCR，篩選陽性克隆．圖3結(jié)果顯示各條帶大小均符合設(shè)計理論值，表明目的片段已正確整合進酵母基因組中．2.3多拷貝重組菌株的篩選

圖4 GAP基因和PSP串聯(lián)基因的標準曲線

GAP基因和PSP串聯(lián)基因的標準曲線及回歸方程見圖4．將實驗所得各陽性菌株的Ct值分別代入標準曲線回歸方程中，求出所檢測的DNA樣品中PSP串聯(lián)基因拷貝數(shù)與GAP基因拷貝數(shù)，兩者比值即為PSP串聯(lián)基因在酵母基因組中的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示第12號菌株在基因組中存在5個拷貝的PSP基因（....

本文編號：4043012