外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌的一種納米級(jí)雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡,能夠直接反映分泌細(xì)胞的生理和功能狀態(tài),進(jìn)行細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸和信息通訊,并參與多種生理及病理過程.本文針對(duì)細(xì)胞分泌外泌體的動(dòng)態(tài)過程,以DNA四面體為基礎(chǔ),結(jié)合細(xì)胞膜修飾技術(shù)和熒光成像技術(shù),構(gòu)建了一種易操作、高穩(wěn)定性的細(xì)胞膜表面DNA四面體傳感器,應(yīng)用于不同細(xì)胞類型分泌外泌體的實(shí)時(shí)監(jiān)測. DNA四面體傳感器通過腳支鏈與疏水性膽固醇探針的雜交互補(bǔ)作用錨定于細(xì)胞膜表面,利用四跨膜蛋白CD63核酸適配體序列特異性捕獲細(xì)胞膜表面釋放的外泌體,通過監(jiān)測細(xì)胞膜表面熒光的變化,實(shí)時(shí)測定外泌體的分泌情況.

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

圖1 DNA四面體傳感器的錨定及實(shí)時(shí)監(jiān)測外泌體分泌的工作原理示意圖

本文以DNA四面體為基礎(chǔ),結(jié)合細(xì)胞膜疏水性修飾技術(shù)和熒光成像技術(shù),構(gòu)建了一種細(xì)胞膜表面DNA四面體傳感器,應(yīng)用于不同細(xì)胞類型分泌外泌體的實(shí)時(shí)監(jiān)測.如圖1所示,膽固醇修飾的錨定探針(AP)首先通過疏水作用固定于細(xì)胞膜表面,DNA四面體傳感器通過25bp延伸腳趾與AP結(jié)合固定于細(xì)胞....

圖2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)驗(yàn)證TDN-F的形成.M:8000 bp DNA Ladder Marker;泳道1:A-F;泳道2:B-S+C-S;泳道3:B-S+C-S+D-S;泳道4:TDN-F;泳道5:TDN-F+QP;泳道6:TDN-F+QP+BP(傳感器).

采用邊長為17bp的DNA四面體來構(gòu)建傳感器.合成DNA四面體結(jié)構(gòu)(TDN-F)的四條鏈(A-F,B-S,C-S,D-S),QP和BP通過自組裝形成傳感器(Sensor),利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)傳感器進(jìn)行表征.如圖2所示,隨著A-F到BP的添加,DNA混合物的凝膠遷移率....

圖3 (A) TDN-F在細(xì)胞膜表面錨定的示意圖及顯微鏡成像;(B) RP置換TDN-F延伸腳趾示意圖;(C) TDN-F固定化驗(yàn)證的顯微鏡成像

以HepG2細(xì)胞作為模型細(xì)胞,研究傳感器的固定化及外泌體捕獲的可行性.通過共聚焦激光掃描顯微鏡驗(yàn)證傳感器固定化的可行性,如圖3A所示,過夜培養(yǎng)的細(xì)胞與1μmol/LAP在37℃下孵育20min,與0.3μmol/LTDN-F孵育1h后,熒光均勻分布于細(xì)胞膜表面,表明TD....

圖4 (A)緩沖液中探針的功能驗(yàn)證;(B)緩沖液中傳感器對(duì)外泌體的響應(yīng)情況

通過熒光光譜法,共聚焦顯微鏡成像和流式細(xì)胞儀分析驗(yàn)證傳感器捕獲外泌體的可行性.首先,在緩沖溶液中評(píng)估探針的功能性及傳感器對(duì)外泌體的響應(yīng)情況.如圖4A所示,TDN-F+QP+Exo中熒光信號(hào)恢復(fù)(綠色曲線),表明外泌體蛋白成功與適配子結(jié)合，將QP從傳感器上置換釋放;TDN-F+QP....

本文編號(hào)：4030243