外泌體是細胞主動分泌的一種納米級雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡,能夠直接反映分泌細胞的生理和功能狀態(tài),進行細胞間的物質(zhì)運輸和信息通訊,并參與多種生理及病理過程.本文針對細胞分泌外泌體的動態(tài)過程,以DNA四面體為基礎(chǔ),結(jié)合細胞膜修飾技術(shù)和熒光成像技術(shù),構(gòu)建了一種易操作、高穩(wěn)定性的細胞膜表面DNA四面體傳感器,應(yīng)用于不同細胞類型分泌外泌體的實時監(jiān)測. DNA四面體傳感器通過腳支鏈與疏水性膽固醇探針的雜交互補作用錨定于細胞膜表面,利用四跨膜蛋白CD63核酸適配體序列特異性捕獲細胞膜表面釋放的外泌體,通過監(jiān)測細胞膜表面熒光的變化,實時測定外泌體的分泌情況.

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【部分圖文】：

圖1 DNA四面體傳感器的錨定及實時監(jiān)測外泌體分泌的工作原理示意圖

本文以DNA四面體為基礎(chǔ),結(jié)合細胞膜疏水性修飾技術(shù)和熒光成像技術(shù),構(gòu)建了一種細胞膜表面DNA四面體傳感器,應(yīng)用于不同細胞類型分泌外泌體的實時監(jiān)測.如圖1所示,膽固醇修飾的錨定探針(AP)首先通過疏水作用固定于細胞膜表面,DNA四面體傳感器通過25bp延伸腳趾與AP結(jié)合固定于細胞....

圖2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)驗證TDN-F的形成.M:8000 bp DNA Ladder Marker;泳道1:A-F;泳道2:B-S+C-S;泳道3:B-S+C-S+D-S;泳道4:TDN-F;泳道5:TDN-F+QP;泳道6:TDN-F+QP+BP(傳感器).

采用邊長為17bp的DNA四面體來構(gòu)建傳感器.合成DNA四面體結(jié)構(gòu)(TDN-F)的四條鏈(A-F,B-S,C-S,D-S),QP和BP通過自組裝形成傳感器(Sensor),利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對傳感器進行表征.如圖2所示,隨著A-F到BP的添加,DNA混合物的凝膠遷移率....

圖3 (A) TDN-F在細胞膜表面錨定的示意圖及顯微鏡成像;(B) RP置換TDN-F延伸腳趾示意圖;(C) TDN-F固定化驗證的顯微鏡成像

以HepG2細胞作為模型細胞,研究傳感器的固定化及外泌體捕獲的可行性.通過共聚焦激光掃描顯微鏡驗證傳感器固定化的可行性,如圖3A所示,過夜培養(yǎng)的細胞與1μmol/LAP在37℃下孵育20min,與0.3μmol/LTDN-F孵育1h后,熒光均勻分布于細胞膜表面,表明TD....

圖4 (A)緩沖液中探針的功能驗證;(B)緩沖液中傳感器對外泌體的響應(yīng)情況

通過熒光光譜法,共聚焦顯微鏡成像和流式細胞儀分析驗證傳感器捕獲外泌體的可行性.首先,在緩沖溶液中評估探針的功能性及傳感器對外泌體的響應(yīng)情況.如圖4A所示,TDN-F+QP+Exo中熒光信號恢復(fù)(綠色曲線),表明外泌體蛋白成功與適配子結(jié)合，將QP從傳感器上置換釋放;TDN-F+QP....

本文編號：4030243