[背景]阿維菌素起始�；D(zhuǎn)移酶（AveAT₀）能夠以2-甲基丁酰-輔酶A （coenzyme A,CoA）和異丁酰-CoA作為起始單元分別合成"a"系列或"b"系列的阿維菌素。[目的]探究AveAT₀對(duì)兩種底物的偏好性并進(jìn)行改造。[方法]通過(guò)與識(shí)別不同底物的起始酰基轉(zhuǎn)移酶（loading acyltransferases,AT₀s）進(jìn)行序列比對(duì),找到AveAT₀底物結(jié)合重要的氨基酸,利用活性位點(diǎn)定點(diǎn)突變的方法得到對(duì)底物偏好性改變的特定突變體。以2-甲基丁酰-CoA、異丁酰-CoA的類似物2-甲基丁酰-N-乙酰半胱氨（N-acetylcysteamine,SNAC）和異丁酰-SNAC為底物,用Ellman測(cè)試法檢測(cè)釋放SNAC的游離巰基（sulfhydryl,SH）,測(cè)定AveAT₀及其突變體的動(dòng)力學(xué)常數(shù),以此表征AveAT₀及其突變體的底物偏好性。[結(jié)果]AveAT₀對(duì)2-甲基丁酰SNAC的Km值為0.4 mmol/L,k_c...

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圖1 阿維菌素PKS起始模塊的AT

在許多大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的生物合成過(guò)程中，AT0充當(dāng)“守門人”的作用，識(shí)別幵且加載起始單元啟動(dòng)聚酮化合物的合成[9]。有些聚酮合酶的起始模塊與阿維菌素的類似，只含有AT0和ACP0，有學(xué)者將其稱為AVE型AT0[4]。與AVE型AT0不同，超過(guò)半數(shù)的PKS起始模塊都含有一個(gè)類似于K....

圖3 AVE型AT0與KSQ型AT0的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

為了檢測(cè)定點(diǎn)突變對(duì)AveAT0水解活性的影響，以MB-SNAC和IB-SNAC為底物，在酶濃度己知的情冴下，通過(guò)特定的底物濃度(2mmol/L)測(cè)得AveAT0及各個(gè)突變體對(duì)MB-SNAC和IB-SNAC的v/E0。從圖5中可以看出，各個(gè)突變體對(duì)MB-SNAC和IB-SNAC的....

圖4 Ave AT0 SDS-PAGE電泳(A)和FPLC分析(B)

圖3AVE型AT0與KSQ型AT0的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖5AveAT0及突變體的水解活性

圖5 AveAT0及突變體的水解活性

圖4AveAT0SDS-PAGE電泳(A)和FPLC分析(B)2.4酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

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