發(fā)布時間：2025-01-17 11:05

　　 植物瞬時表達是一種高效快速獲得外源基因表達的方法,該系統(tǒng)主要應(yīng)用于蛋白互作研究、調(diào)控元件功能分析、蛋白亞細胞定位和蛋白制劑合成等方面。為了進一步提高外源基因在瞬時表達體系中穩(wěn)定表達效果,本研究對瞬時表達載體的多種作用元件及轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化。首先,我們在目前最常用的雙元表達載體pCambia1300骨架上,分別添加可增強特異性轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定蛋白表達的新的調(diào)控元件,構(gòu)建pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF重組表達載體,并且通過定性和定量方法分析不同元件組合、不同菌液濃度對報告基因eGFP表達的影響。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果證明3個重組載體可在煙草葉片的細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中快速表達報告基因;定量PCR分析表明3個重組載體中報告基因在轉(zhuǎn)錄表達水平上分別比原pCambia1301-eGFP載體提高了4倍、20倍和28倍;蛋白水平分析表明煙草葉片轉(zhuǎn)化48 h后,pREUR-EF外源蛋白表達量明顯高于pREU-EF;并且當(dāng)菌液注射液濃度OD₆₀₀=0.4左右時,外源蛋白的表達效率最高。此外,我們還進一步把改造后的瞬時表達重組載體運用到雙熒光素酶（Dual-...

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【部分圖文】：

圖1 重組表達載體構(gòu)建及驗證

根據(jù)1.2.3實驗方法分別將pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF3個重組表達載體轉(zhuǎn)化煙草葉片，48h后，利用激光共聚焦顯微鏡分析煙草葉片中報告基因GFP的表達情況。結(jié)果（圖2）表明，在細胞質(zhì)、細胞核、細胞膜中均能觀察到GFP的表達，初步說明構(gòu)建的3個瞬時....

圖2 重組表達載體侵染后煙草葉片中GFP表達分析

圖1重組表達載體構(gòu)建及驗證2.3作用元件組合與目標蛋白表達相關(guān)性分析

圖4 對比分析不同注射液濃度對pREUR-EF載體中報告基因GFP表達的影響

為驗證改造的瞬時表達系統(tǒng)是否可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控Dual-Luciferase分析，將擬南芥花藥特異表達的轉(zhuǎn)錄因子AtMYB80和AMS(ABORTEDMICROSPORES）分別連入pREUR-EF載體，來驗證AtMYB80對其下游基因天冬氨酸蛋白酶UNDEAD轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。Ef....

圖5 轉(zhuǎn)錄因子MYB80對UNDEAD的調(diào)控分析

植物瞬時表達系統(tǒng)具有廣泛應(yīng)用，既可以用于快速研究基因功能，也可以用于獲取重組蛋白。已有研究表明，目的蛋白性質(zhì)、宿主、表達載體系統(tǒng)、密碼子偏好性、轉(zhuǎn)化條件等因素都會影響外源蛋白表達[4]。表達載體系統(tǒng)中各作用元件的優(yōu)化一直是進一步提高外源蛋白的研究熱點。在本研究中，我們挖掘和比較文....

本文編號：4027977