植物瞬時(shí)表達(dá)是一種高效快速獲得外源基因表達(dá)的方法,該系統(tǒng)主要應(yīng)用于蛋白互作研究、調(diào)控元件功能分析、蛋白亞細(xì)胞定位和蛋白制劑合成等方面。為了進(jìn)一步提高外源基因在瞬時(shí)表達(dá)體系中穩(wěn)定表達(dá)效果,本研究對(duì)瞬時(shí)表達(dá)載體的多種作用元件及轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化。首先,我們?cè)谀壳白畛Ｓ玫碾p元表達(dá)載體pCambia1300骨架上,分別添加可增強(qiáng)特異性轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定蛋白表達(dá)的新的調(diào)控元件,構(gòu)建pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF重組表達(dá)載體,并且通過(guò)定性和定量方法分析不同元件組合、不同菌液濃度對(duì)報(bào)告基因eGFP表達(dá)的影響。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果證明3個(gè)重組載體可在煙草葉片的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中快速表達(dá)報(bào)告基因;定量PCR分析表明3個(gè)重組載體中報(bào)告基因在轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上分別比原pCambia1301-eGFP載體提高了4倍、20倍和28倍;蛋白水平分析表明煙草葉片轉(zhuǎn)化48 h后,pREUR-EF外源蛋白表達(dá)量明顯高于pREU-EF;并且當(dāng)菌液注射液濃度OD₆₀₀=0.4左右時(shí),外源蛋白的表達(dá)效率最高。此外,我們還進(jìn)一步把改造后的瞬時(shí)表達(dá)重組載體運(yùn)用到雙熒光素酶（Dual-...

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圖1 重組表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證

根據(jù)1.2.3實(shí)驗(yàn)方法分別將pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF3個(gè)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草葉片，48h后，利用激光共聚焦顯微鏡分析煙草葉片中報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況。結(jié)果（圖2）表明，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜中均能觀察到GFP的表達(dá)，初步說(shuō)明構(gòu)建的3個(gè)瞬時(shí)....

圖2 重組表達(dá)載體侵染后煙草葉片中GFP表達(dá)分析

圖1重組表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證2.3作用元件組合與目標(biāo)蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

圖4 對(duì)比分析不同注射液濃度對(duì)pREUR-EF載體中報(bào)告基因GFP表達(dá)的影響

為驗(yàn)證改造的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是否可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控Dual-Luciferase分析，將擬南芥花藥特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子AtMYB80和AMS(ABORTEDMICROSPORES）分別連入pREUR-EF載體，來(lái)驗(yàn)證AtMYB80對(duì)其下游基因天冬氨酸蛋白酶UNDEAD轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。Ef....

圖5 轉(zhuǎn)錄因子MYB80對(duì)UNDEAD的調(diào)控分析

植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)具有廣泛應(yīng)用，既可以用于快速研究基因功能，也可以用于獲取重組蛋白。已有研究表明，目的蛋白性質(zhì)、宿主、表達(dá)載體系統(tǒng)、密碼子偏好性、轉(zhuǎn)化條件等因素都會(huì)影響外源蛋白表達(dá)[4]。表達(dá)載體系統(tǒng)中各作用元件的優(yōu)化一直是進(jìn)一步提高外源蛋白的研究熱點(diǎn)。在本研究中，我們挖掘和比較文....

本文編號(hào)：4027977