植物生長(zhǎng)發(fā)育受到多種因素的調(diào)控,其中外部因素,如光照、溫度、濕度等,對(duì)其正常的生長(zhǎng)發(fā)育具有關(guān)鍵作用。植物的光合作用為其生命活動(dòng)提供能量,而且光照也可以作為一種輸入信號(hào)引起植物體內(nèi)發(fā)生相應(yīng)變化,隨時(shí)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)。溫度也是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的因子之一,在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,植物體內(nèi)也形成了一套復(fù)雜的感知以及響應(yīng)外界溫度變化的系統(tǒng),可以很好地適應(yīng)環(huán)境溫度的升高或降低。然而,過(guò)強(qiáng)的光照或過(guò)激的溫度變化均會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)不利影響,甚至導(dǎo)致其死亡。因此,探究植物如何感受外界環(huán)境的變化以及這種變化如何通過(guò)調(diào)控內(nèi)在的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)以促使植物做出適應(yīng)性改變,對(duì)于我們更好地改良農(nóng)作物品質(zhì)及增加產(chǎn)量具有重要的指導(dǎo)意義。本研究在模式植物擬南芥中開展,主要研究SHB1與CCA1/LHY形成的蛋白復(fù)合體特異性地在紅光條件下調(diào)控PIF4基因的表達(dá)。PIF4(PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4)是植物光形態(tài)建成過(guò)程中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子之一,參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面,同時(shí)也是植物熱形態(tài)建成過(guò)程中的關(guān)鍵因子;SHB1(SHORT HYPOCOTYL UNDER BLUE 1)...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 植物光形態(tài)建成
        1.1.1 植物光受體
            1.1.1.1 光敏色素
            1.1.1.2 隱花色素與向光素
            1.1.1.3 UVR
        1.1.2 光敏色素互作因子
            1.1.2.1 PIFs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
            1.1.2.2 PIF4 多方面地參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育
    1.2 植物生物節(jié)律
        1.2.1 擬南芥生物鐘核心振蕩器的分子機(jī)制
        1.2.2 光、溫信號(hào)與生物鐘之間的聯(lián)系
    1.3 SHB1 在植物光形態(tài)建成中的作用
    1.4 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與質(zhì)粒
        2.1.3 酶與試劑
        2.1.4 儀器設(shè)備
        2.1.5 引物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 各種培養(yǎng)基配方
        2.2.2 植物材料的生長(zhǎng)
            2.2.2.1 擬南芥種子消毒處理及萌發(fā)
            2.2.2.2 擬南芥植物的正常生長(zhǎng)
            2.2.2.3 擬南芥植物的高溫條件處理
            2.2.2.4 擬南芥幼苗下胚軸長(zhǎng)度的測(cè)量
        2.2.3 構(gòu)建擬南芥轉(zhuǎn)基因植物
            2.2.3.1 植物基因組DNA的提取(SDS法)
            2.2.3.2 PCR擴(kuò)增目的基因片段
            2.2.3.3 目的片段的回收(試劑盒法)
            2.2.3.4 TOPO TA連接反應(yīng)
            2.2.3.5 大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)法)
            2.2.3.6 PCR篩選方向及質(zhì)粒提取(試劑盒法)
            2.2.3.7 LR反應(yīng)
            2.2.3.8 PCR鑒定陽(yáng)性菌
            2.2.3.9 農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)法)
            2.2.3.10 浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥植物
        2.2.4 雙、三突變體的構(gòu)建及鑒定
            2.2.4.1 擬南芥植物的雜交
            2.2.4.2 PCR鑒定純合突變體
        2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)
            2.2.5.1 植物總RNA的提取(試劑盒法)
            2.2.5.2 反轉(zhuǎn)錄
            2.2.5.3 qRT-PCR的引物設(shè)計(jì)及合成
            2.2.5.4 qRT-PCR的反應(yīng)體系及結(jié)果分析
        2.2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀分析(ChIP)
            2.2.6.1 染色體與蛋白交聯(lián)
            2.2.6.2 染色體準(zhǔn)備(4°C)
            2.2.6.3 免疫共沉淀(4°C)
            2.2.6.4 洗脫與解交聯(lián)
            2.2.6.5 沉淀DNA
        2.2.7 免疫共沉淀分析(Co-IP)
            2.2.7.1 植物總蛋白的提取
            2.2.7.2 免疫共沉淀
            2.2.7.3 Western blot
        2.2.8 酵母單雜交(Y1H)
            2.2.8.1 pAbAi-Bait質(zhì)粒的構(gòu)建及線性化
            2.2.8.2 Y1H酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.8.3 酵母菌的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的篩選
            2.2.8.4 pAbAi-Bait酵母菌株的AbA抗性檢測(cè)
            2.2.8.5 制備含有pAbAi-Bait質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細(xì)胞以及不同GAD質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.2.9 雙分子熒光互補(bǔ)分析(BiFC)
            2.2.9.1 煙草轉(zhuǎn)化
        2.2.10 雙分子熒光素酶活性分析
            2.2.10.1 擬南芥葉片原生質(zhì)體的提取與轉(zhuǎn)化
            2.2.10.2 LUC/REN活性檢測(cè)
3 結(jié)果與分析
    3.1 SHB1、CCA1/LHY特異性地在紅光條件下調(diào)控PIF4 的表達(dá)
        3.1.1 SHB1 在紅光條件下特異性地誘導(dǎo)PIF4 基因表達(dá)
        3.1.2 SHB1 在紅光條件下促進(jìn)PIF4 蛋白積累
        3.1.3 CCA1、LHY參與調(diào)控PIF4 基因表達(dá)
    3.2 SHB1、CCA1、LHY與 PIF4 的遺傳關(guān)系鑒定
    3.3 SHB1與CCA1/LHY上調(diào)PIF4 基因表達(dá)可增強(qiáng)植物的熱形態(tài)建成
    3.4 SHB1 通過(guò)CCA1/LHY關(guān)聯(lián)至PIF4 基因啟動(dòng)子區(qū)域
        3.4.1 SHB1 在紅光條件下與PIF4 基因啟動(dòng)子相關(guān)聯(lián)
        3.4.2 CCA1/LHY在紅光條件下可結(jié)合至PIF4 基因啟動(dòng)子
        3.4.3 CCA1/LHY在黑暗條件下無(wú)法結(jié)合PIF4 基因啟動(dòng)子
        3.4.4 SHB1與CCA1/LHY結(jié)合PIF4 基因啟動(dòng)子符合PIF4 基因的節(jié)律表達(dá)模式
    3.5 CCA1/LHY可直接結(jié)合至PIF4 基因啟動(dòng)子中的M1 元件
    3.6 SHB1與CCA1/LHY相互作用
    3.7 SHB1 N端與CCA1/LHY C端互作
    3.8 CCA1/LHY與 SHB1 共同作用于PIF
4 討論
    4.1 SHB1 通過(guò)上調(diào)PIF4 表達(dá)有助于維持植物光形態(tài)建成的動(dòng)態(tài)平衡
    4.2 SHB1 特異性地調(diào)控PIF4 基因的表達(dá)
    4.3 PIF4 蛋白水平與轉(zhuǎn)錄水平具有一致的節(jié)律表達(dá)模式
    4.4 CCA1/LHY在黑暗條件下無(wú)法結(jié)合至PIF4 基因啟動(dòng)子
    4.5 SHB1-CCA1/LHY復(fù)合體結(jié)合PIF4 基因啟動(dòng)子符合其節(jié)律表達(dá)模式
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況



本文編號(hào)：4006294