目的構(gòu)建模擬胚胎期不同造血部位的造血微環(huán)境體系用于體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)向造血細胞分化,并初步評價分化效率。方法采用體視顯微鏡及HE染色觀察E11.5小鼠胚胎卵黃囊(YS)、胎盤(PL)和胎肝(FL)的解剖部位和形態(tài);選取E7.5～E9.5、 E10.5～E12.5及E13.5～E15.5胚胎YS、 PL和FL組織進行基質(zhì)細胞培養(yǎng)并制備條件培養(yǎng)液,即為卵黃囊基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(YSSC-CM)、胎盤基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(PLSC-CM)和胎肝基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(FLSC-CM),與體外擴增的SD大鼠BMSC共培養(yǎng)。實驗分為對照組、白細胞介素6(IL-6)聯(lián)合干細胞因子(SCF)處理組、 YSSC-CM處理組、 PLSC-CM處理組和FLSC-CM處理組。共培養(yǎng)7～9 d,收集培養(yǎng)液中漂浮細胞。吉姆薩染色檢測細胞形態(tài),直接免疫熒光術(shù)檢測細胞表面特異性分子CD34和CD45的表達,集落形成實驗檢測粒-巨噬細胞集落形成單位(GM-CFU)鑒定分化細胞。結(jié)果體視顯微鏡下觀察鼠胚PL和FL與人胚的位置相同,而YS是包裹在胚體及羊膜的外側(cè), HE染色顯示PL血管迷路、 FL血竇和YS血...

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【部分圖文】：

圖1SD大鼠BMSC的培養(yǎng)和鑒定

采用全骨髓法結(jié)合差速貼壁法從SD大鼠骨髓分離BMSC。傳代純化后細胞形態(tài)趨于一致,以長梭形與紡錘形為主,細胞集落排列成魚群狀或旋渦狀。細胞體積較大,有1～2個圓形或橢圓形核,核仁清晰(圖1A)。成骨誘導(dǎo)可見典型的鈣結(jié)節(jié)(圖1B)。成脂誘導(dǎo)可見細胞間和細胞內(nèi)存在紅色脂滴(圖....

圖2體視顯微鏡觀察E11.5的BALB/c小鼠胚胎不同造血部位

體視顯微鏡下,無菌取材,胚胎、胎體、卵黃囊、胎肝、胎盤(圖2),單個胚胎呈梨形。剝離胎膜后,可見YS為一層富含血管的透明膜囊,包裹羊膜與胎體,附著于PL中心。PL為一圓盤狀結(jié)構(gòu),鏡下觀察PL胎兒面中央呈鮮紅色,周邊顏色較淺。FL位于心臟下方,呈鮮紅色,....

圖3HE染色檢測E11.5的BALB/c小鼠胚胎不同造血部位形態(tài)特征

圖2體視顯微鏡觀察E11.5的BALB/c小鼠胚胎不同造血部位2.3YSSC-CM、PLSC-CM和FLSC-CM的采集

圖4原代培養(yǎng)第5天細胞圖像(相差顯微鏡,×100)

消化后的卵黃囊、胎盤和胎肝細胞培養(yǎng)48h后,均可見有數(shù)量不等的貼壁細胞,呈多角形或梭形,每3～4d換液1次,5～7d細胞匯合可達80%左右(圖4),此時換用無血清高糖DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h后,收集上清,用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌及....

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