黑曲霉作為國(guó)際公認(rèn)的GRAS菌株廣泛應(yīng)用于有機(jī)酸、酶制劑及外源蛋白表達(dá)宿主等領(lǐng)域。真菌轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(FTFD)中收錄了775個(gè)經(jīng)基因組測(cè)序預(yù)測(cè)的黑曲霉轉(zhuǎn)錄因子,這其中只有5%的轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)傳統(tǒng)方法進(jìn)行了功能表征,大部分轉(zhuǎn)錄因子功能研究仍處于空白狀態(tài),并且其全基因組水平的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)信息及其調(diào)控機(jī)制研究甚少。在絲狀真菌中,轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)調(diào)控功能,比如生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞過(guò)程和刺激響應(yīng)。因此解析其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對(duì)于黑曲霉的宿主改造、遺傳調(diào)控機(jī)制研究都具有重要價(jià)值。基于以上目的,本文主要以不同曲霉菌株為研究對(duì)象,為黑曲霉遺傳調(diào)控位點(diǎn)的定向改造提供了新工具并結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)解析全基因組水平的不同類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)及其調(diào)控機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建適合黑曲霉的單堿基編輯平臺(tái)基于已有的基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9,將其活性蛋白Cas9失活成只具有單鏈切割活性的n Cas9,然后與胞嘧啶脫氨酶(r APOBEC1)和尿嘧啶核苷糖基化抑制子(UGI)融合成能在黑曲霉中正常表達(dá)且發(fā)揮堿基編輯功能的單堿基編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以通過(guò)堿基定點(diǎn)突變對(duì)...

【文章頁(yè)數(shù)】：185 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖1-1黑曲霉菌落、孢子和菌絲形態(tài)[1,2]

第一章緒論1第一章緒論1.1黑曲霉概述黑曲霉（Aspergillusniger）是一種重要的絲狀真菌。在分類(lèi)學(xué)上屬子囊菌亞門(mén)，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬[1]。其生長(zhǎng)的最適溫度為35~37℃，pH為3~7[1]。根據(jù)其形態(tài)學(xué)可以分為有孢（Conidial）黑曲霉和無(wú)孢（Ac....

圖1-2CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)總覽和DNA修復(fù)機(jī)制[23]

華南理工大學(xué)博士學(xué)位論文6Cas9蛋白產(chǎn)生的DSBs通過(guò)前文所述的NHEJ和HR兩種方式進(jìn)行修復(fù)，NHEJ可以通過(guò)小片段刪除和插入實(shí)現(xiàn)基因敲除；HR可以引入外源DNA實(shí)現(xiàn)基因敲除和外源蛋白表達(dá)（圖1-2）。圖1-2CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)總覽和DNA修復(fù)機(jī)制[23]Fi....

圖1-3CRISPR/Cas9系統(tǒng)在絲狀真菌中的應(yīng)用[23]

第一章緒論7因進(jìn)行敲除，克服了使用HR方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)[27]。為了進(jìn)一步提升基因編輯效率，一方面從Cas9蛋白的密碼子優(yōu)化著手；另一方面尋找適合黑曲霉自身的sgRNA啟動(dòng)子[28,29]：從最初使用的錘頭酶[24]慢慢發(fā)展成使用異源U6啟動(dòng)子[27,30]，隨后自身的U6啟動(dòng)....

圖1-4真核生物染色質(zhì)組成及其動(dòng)態(tài)調(diào)控[35]

第一章緒論9transferase,DNMTs）以S-腺苷甲硫氨酸SAM為甲基供體，對(duì)DNA雙鏈中的CpG島區(qū)域內(nèi)的胞嘧啶（Cytimidine，C）特異性地添加上CH3基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)胞嘧啶轉(zhuǎn)換為5-甲基胞嘧啶的反應(yīng)[36]。真核生物細(xì)胞內(nèi)的DNA甲基化主要有持續(xù)的低甲基化狀態(tài)，可誘....

本文編號(hào)：3973722