目的:擬建立一種方便快捷、經(jīng)濟(jì)有效的細(xì)胞核質(zhì)分離鑒定方法。方法:本研究從DNA水平進(jìn)行核質(zhì)分離鑒定,選擇GAPDH、ND1分別作為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)標(biāo)志基因,并根據(jù)GAPDH及ND1序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,基于熒光定量PCR方法定性檢測(cè)核質(zhì)分離的效果。隨后將本鑒定方法應(yīng)用于其他種類細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞、GT1-7細(xì)胞)及組織(小鼠心臟、肝臟、大腦)的核質(zhì)分離鑒定。結(jié)果:在293T細(xì)胞應(yīng)用該鑒定方法鑒定核質(zhì)分離效果,結(jié)果顯示:GAPDH、ND1在核組、質(zhì)組中的含量存在明顯差異,其中核標(biāo)志基因GAPDH在細(xì)胞核中的比例達(dá)到了95%以上,質(zhì)標(biāo)志基因ND1在細(xì)胞質(zhì)中的比例也達(dá)到了90%左右,這與從RNA水平及蛋白水平鑒定核質(zhì)分離的結(jié)果一致。在其他種類的細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞、GT1-7細(xì)胞)及組織(小鼠心臟、肝臟、大腦)應(yīng)用該方法結(jié)果顯示:細(xì)胞核組分中質(zhì)標(biāo)志基因ND1含量比293T細(xì)胞的有所增加,但仍可以實(shí)現(xiàn)核質(zhì)分離鑒定。結(jié)論:本研究所建立的核質(zhì)分離質(zhì)控方法可以實(shí)現(xiàn)從DNA水平進(jìn)行核質(zhì)分離的鑒定,該方法更加經(jīng)濟(jì)、快捷。

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

在從DNA水平鑒定核質(zhì)分離效果過程中，可以看出：當(dāng)使用中等強(qiáng)度的裂解液（mRIPA）進(jìn)行核質(zhì)分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)核基因在細(xì)胞質(zhì)中含量較高的現(xiàn)象，而當(dāng)使用弱裂解液（L1和L2lysate）進(jìn)行核質(zhì)分離時(shí)，質(zhì)基因在細(xì)胞核中的含量較高，這也是由兩種裂解液自身屬性決定的[22]，所以，....

圖3新建立的核質(zhì)分離質(zhì)控方法在兩種細(xì)胞中的應(yīng)用在研究核質(zhì)分離裂解液裂解不同時(shí)間對(duì)核質(zhì)分離的影響時(shí)，本研究選擇了單拷貝的GAPDH基因[23]而不是多拷貝的ND1基因，這是由于存在于細(xì)胞中的ND1含量和細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)，即細(xì)胞狀態(tài)的微小差異就可能會(huì)對(duì)細(xì)胞中ND1含量造成很大的影響....

L2裂解液裂解不同時(shí)間對(duì)核質(zhì)分離的影響見圖1f。離心5min時(shí)，隨著裂解時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)中核基因所占的比例越來越高。至于裂解時(shí)間，由于核質(zhì)分離時(shí)需要用核質(zhì)分離裂解液將沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊吹打均勻，這一步驟本身需要一定的時(shí)間，所以如果裂解時(shí)間太短；而裂解時(shí)間太長(zhǎng)又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中核基因....

細(xì)胞所處的時(shí)期與其分裂狀態(tài)密切相關(guān)[17]，若細(xì)胞處于分裂期，核仁核膜消失[18]，此時(shí)無法較好地對(duì)核質(zhì)進(jìn)行分離，這也是核質(zhì)分離時(shí)，核質(zhì)不能徹底分開的一個(gè)重要原因[9,19]。所以，本研究在進(jìn)行核質(zhì)分離時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)到90%以上，此時(shí)由于細(xì)胞間的接觸抑制[20]，絕大多數(shù)細(xì)胞停留在....

本文編號(hào)：3966547