為了進(jìn)行CRISPR文庫篩選,本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法利用N2a細(xì)胞構(gòu)建表達(dá)Cas9蛋白的N2aCas9單克隆細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)將LentiCas9-Blast、pSPA X2和pMD 2.G 3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(HEK293T)獲取高滴度的重組慢病毒,收集重組慢病毒并感染N2a細(xì)胞,經(jīng)殺稻瘟菌素(Blasticidin)篩選,通過有限稀釋法獲得含有Cas9基因的多個(gè)單克隆細(xì)胞株。Western blot結(jié)果顯示候選細(xì)胞系高水平表達(dá)Cas9蛋白;利用慢病毒表達(dá)報(bào)告基因載體系統(tǒng)檢測(cè)顯示候選細(xì)胞系的Cas9蛋白具有很高的切割活力;利用CellTiter-Glo試劑檢測(cè)結(jié)果顯示,Cas9基因在候選細(xì)胞系內(nèi)高表達(dá)但不影響細(xì)胞增殖活性。本研究利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的N2a-Cas9單克隆細(xì)胞系,為基于CRISPR/Cas9全基因組高通量篩選技術(shù)探究神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵宿主基因調(diào)控狂犬病病毒嗜神經(jīng)性提供研究基礎(chǔ)。

【文章頁數(shù)】：4 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞株
    1.2 主要試劑
    1.3 慢病毒的包裝和感染劑量的確定
    1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染和N2a表達(dá)Cas9蛋白細(xì)胞系的獲得
    1.5 表達(dá)Cas9蛋白的N2a細(xì)胞切割活力檢測(cè)
    1.6 N2a-Cas9細(xì)胞活力檢測(cè)
2 結(jié)果與討論
    2.1 慢病毒感染劑量的確定
    2.2 表達(dá)Cas9蛋白N2a細(xì)胞系的獲得
    2.3 表達(dá)Cas9蛋白的N2a細(xì)胞切割活力檢測(cè)結(jié)果
    2.4 N2a-Cas9細(xì)胞系活性的測(cè)定結(jié)果



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