研究背景及意義:東方蠑螈具有很強(qiáng)的再生能力,是肢體再生的理想模式物種。蠑螈肢體再生涉及多種復(fù)雜的生物學(xué)過程,肢體再生的不同階段會激活不同的基因、啟動不同的信號通路、合成不同的蛋白質(zhì)、形成不同的組織。盡管已有組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物分子和信號通路調(diào)控作用等方面的研究,有助于我們深入了解蠑螈肢體再生的過程,但肢體再生的分子機(jī)理仍不清楚。本研究利用高通量測序?qū)ο旙⒅w再生中的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和miRNA組進(jìn)行分析,揭示了蠑螈肢體再生動態(tài)調(diào)控過程,為探討蠑螈肢體再生的調(diào)控機(jī)制,提供了重要的理論依據(jù)。研究方法:本研究以東方蠑螈截肢后五個不同再生時間點(3 dpa、7 dpa、14 dpa、30 dpa和42 dpa)的再生肢體組織為研究對象,建立東方蠑螈肢體再生模型。1、利用RNA-seq技術(shù),獲得東方蠑螈肢體再生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出肢體再生過程中差異表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,并通過qPCR進(jìn)行驗證。2、利用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù),獲得東方蠑螈肢體再生的蛋白表達(dá)譜,篩選差異表達(dá)蛋白,并進(jìn)行GO和KEGG富集分析。3、利用miRNA-seq測序技術(shù),對肢體再生中的miRNA進(jìn)行發(fā)掘分析,對所有差異表...

【文章頁數(shù)】：175 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語對照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 前言
    1.2 東方蠑螈概述
    1.3 蠑螈肢體再生研究進(jìn)展
        1.3.1 肢體再生的階段
        1.3.2 免疫系統(tǒng)與肢體再生
        1.3.3 神經(jīng)系統(tǒng)與肢體再生
        1.3.4 斷肢細(xì)胞的位置記憶
        1.3.5 肢體再生中的信號通路
    1.4 組學(xué)技術(shù)在再生中的研究
        1.4.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用
        1.4.2 iTRAQ技術(shù)及其應(yīng)用
        1.4.3 miRNA技術(shù)及其應(yīng)用
    1.5 研究目的和意義
    1.6 研究內(nèi)容和技術(shù)路線
第二章 東方蠑螈斷肢再生模型建立及再生肢體組織的轉(zhuǎn)錄組分析
    2.1 前言
    2.2 實驗材料與方法
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 試劑
        2.2.3 主要儀器設(shè)備
        2.2.4 石蠟切片制備及HE染色
        2.2.5 總RNA的提取
        2.2.6 cDNA文庫構(gòu)建
        2.2.7 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理
        2.2.8 生物信息學(xué)分析
        2.2.9 差異基因分析
        2.2.10 熒光定量PCR驗證
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察
        2.3.2 Illumina測序與組裝
        2.3.3 基因注釋與功能分類
        2.3.4 差異基因分析
        2.3.5 差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析
        2.3.6 與免疫反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的差異基因的鑒定
        2.3.7 實時熒光定量PCR
    2.4 討論
        2.4.1 蠑螈肢體再生的觀察
        2.4.2 Illumina測序與de novo拼接
        2.4.3 肢體再生過程中的差異基因
    2.5 本章小結(jié)
第三章 肢體再生過程中蛋白組研究
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 試驗動物
        3.2.2 主要實驗試劑
        3.2.3 蛋白提取及濃度測定
        3.2.4 蛋白酶解和iTRAQ標(biāo)記
        3.2.5 SCX分離和LC-MS/MS分析
        3.2.6 蛋白質(zhì)鑒定和定量
        3.2.7 生物信息學(xué)分析
        3.2.8 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
        3.3.2 差異蛋白分析
        3.3.3 生物信息學(xué)分析
        3.3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)
    3.4 討論
        3.4.1 傷口愈合
        3.4.2 芽基形成
        3.4.3 細(xì)胞分化和肢體再生
    3.5 本章小結(jié)
第四章 肢體再生過程中mirco RNA研究
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 試驗動物
        4.2.2 主要試劑和儀器設(shè)備
        4.2.3 主要數(shù)據(jù)庫
        4.2.4 總RNA 提取及質(zhì)量檢測
        4.2.5 小RNA文庫的構(gòu)建與測序
        4.2.6 miRNA測序數(shù)據(jù)分析
        4.2.7 miRNA差異表達(dá)分析
        4.2.8 靶基因預(yù)測
        4.2.9 mi RNA熒光定量PCR驗證
        4.2.10 質(zhì)粒構(gòu)建
        4.2.11 雙熒光素酶檢測
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 測序數(shù)據(jù)分析
        4.3.2 miRNA的分類與鑒定
        4.3.3 不同再生時期micro RNA差異表達(dá)分析
        4.3.4 差異miRNA的靶基因生物信息學(xué)分析
        4.3.5 mi RNA-protein關(guān)聯(lián)分析
        4.3.6 mi RNA的實時熒光定量PCR驗證
        4.3.7 mi RNA的靶向基因預(yù)測及雙熒光素酶報告基因(DLR)檢測
    4.4 討論
        4.4.1 mi RNA-seq測序技術(shù)的mi RNA研究
        4.4.2 miRNA對芽基形成的調(diào)控作用
    4.5 本章小結(jié)
第五章 東方蠑螈肢體再生過程中差異表達(dá)蛋白的驗證
    5.1 前言
    5.2 實驗材料
        5.2.1 試驗動物
        5.2.2 實驗試劑
        5.2.3 實驗儀器
        5.2.4 試劑配置
    5.3 實驗方法
        5.3.1 序列分析
        5.3.2 多克隆抗體的制備
        5.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析
        5.3.4 Western Blot
        5.3.5 免疫熒光染色
    5.4 結(jié)果
        5.4.1 序列分析
        5.4.2 CORO1A、CAPG、ANXA1和AGR物種間多重序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
        5.4.3 PCR擴(kuò)增Coro1a、Capg、Anxa1和Agr基因
        5.4.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建
        5.4.5 重組蛋白的原核表達(dá)
        5.4.6 多克隆抗體的Western Blot鑒定
        5.4.7 石蠟切片免疫熒光染色結(jié)果
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
第六章 全文總結(jié)
    6.1 總結(jié)
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 研究展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀博士學(xué)位期間取得的科研成果
作者簡介



本文編號：3951105