隨著石化資源的不斷消耗,氣候的不斷惡化,人們逐漸從石化經(jīng)濟(jì)向生物經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)變,利用可再生資源生產(chǎn)高附加值生物制品是實(shí)現(xiàn)社會可持續(xù)發(fā)展和循環(huán)經(jīng)濟(jì)的必然選擇。3-羥基丙酸(3-HP)兩次被美國能源部評選為優(yōu)先開發(fā)的化學(xué)品之一,以其為前體可合成多種具有商業(yè)價(jià)值的化合物,被廣泛用于材料、化工、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。目前,3-HP以生物法中基因工程菌合成為主,具有合成產(chǎn)量高、途徑易改善等優(yōu)點(diǎn)。本文使用葡萄糖為唯一碳源,選取遺傳背景清晰、廉價(jià)易得的大腸桿菌(Escherichia coli)為宿主菌株構(gòu)建丙二酸單酰輔酶A途徑,通過對代謝通路的改造達(dá)到高效合成3-HP的目的。主要內(nèi)容如下:(1)以實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)3對含同源片段的引物,通過PCR擴(kuò)增出目的片段,利用重組連接酶構(gòu)建含丙二酸單酰輔酶A還原酶mcr基因的重組質(zhì)粒pA2c-mcr,對其進(jìn)行菌液PCR、酶切及測序驗(yàn)證,并對目的蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。(2)為提高丙二酸單酰輔酶A還原酶(MCR)的活性,利用定點(diǎn)突變技術(shù)設(shè)計(jì)兩對突變引物,構(gòu)建含多個(gè)突變位點(diǎn)(N940V/K1106W/S114R)的重組質(zhì)粒pA2c-mcr*,菌液PCR及測序驗(yàn)證表明位點(diǎn)已成...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２甘油途徑合成３－ＨＰ??Ｆｉｇ．?１－２?Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｏｆ?３－ＨＰ?ｂｙ?ｇｌｙｃｅｒｏｌ?ｐａｔｈｗａｙ??（ｉ）

ｃｅｎＧＳ＜?ｌ?？?Ｏ??Ｖ?ｉｉ??３－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ?３－Ｈｙｄｒｏｘｖｐｒｏｐｉｏｎｉｃ?ａｃｉｄ??ｗｄ?個(gè)??／?＾?ｒ－Ｘｉｄ＇ＪＴＣｌＪＵＣＵＳＣ??—“ＡＤＨ．?＼?八?＝?著??＞?ｒ?１．３－Ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ??，？，八＾....

圖１－３丙二酸單酰輔酶Ａ途徑合成３－ＨＰ??Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｏｆ?３－ＨＰ?ｂｙ?ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ?ｐａｔｈｗａｙ??

?１緒論???羧化成丙二酸單酰輔酶Ａ，再利用２ｍｏｌＮＡＤＰＨ還原成３－ＨＰ。該途徑因具有很好地能??量平衡及較高的轉(zhuǎn)化效率被廣為研宄。??ｓ?ｃｌ！??Ｇ一－夸八，—＿＞??Ａｃｅｔｖｉ－ＣｏＡ?Ｈ０＞?ＭａｌｃＭｉｖｉ－ＣｏＡ??ＮＡＤＰｆｉ?Ｎ??ＫＡＤＰ＾??ｙ??Ｍａｌ....

圖１－４卩－丙氨酸途徑合成３－ＨＰ??Ｆｉｇ．?１－４?Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｏｆ?３－ＨＰ?ｂｙ?ｐ－ａｌａｎｉｎｅ?ｐａｔｈｗａｙ??

３－丙氨酸途徑，并獲得較高的產(chǎn)量。??Ｇｌｍ：ｏｓｅ?ｑ??、＇▲廠、?Ａ?／＼?ｐ?１??＾ＴＣＡＣｙｃｋ?＿＿＾Ｋ０－??Ｆｕｍａｒａｔｅ?ｐ－ａｌａｎｉｎｅ??ｐ＞ＴＵｖａｒｅ?｜?＾－ａｌａｎｍｅ?ｐ＞Ｔｉｎ＇３ｔｅ??Ｌ－ａｌａｕｍｅ?Ｉ?ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓ....

圖２－］蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線??Ｆ．－１ａｒｄｒｖｅ?ｏｅｃｎｅ

的ＬＢ液體培養(yǎng)基中３７°Ｃ、２２０?ｒｐｍ／ｍｉｎ過夜培養(yǎng)１２－１６?ｈ，提取質(zhì)粒并送至測序??公司測序。??２．３．１２蛋白質(zhì)濃度的測定??本實(shí)驗(yàn)采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法測定蛋白質(zhì)濃度。當(dāng)考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)后，會在??分光光度計(jì)的５９５?ｎｍ處有最大的吸收峰，且測得的吸光....

本文編號：3939638