YY1作為一個多功能的轉(zhuǎn)錄因子,根據(jù)其招募的輔助因子激活或抑制基因表達。YY1的C-末端由四個鋅指結(jié)構(gòu)組成,并負責其與DNA結(jié)合。然而,YY1四個鋅指各自對其功能的影響尚未完全闡明。在本研究中,利用丙氨酸取代YY1中鋅指與DNA結(jié)合所必需的半胱氨酸,研究半胱氨酸突變對YY1與DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性的影響,以及對YY1在促進MDA-MB-231細胞增殖中的作用。得出如下結(jié)果:1.在原核表達系統(tǒng)中表達并純化野生型(wt)和突變體YY1蛋白,在這些YY1突變體中,每個鋅指中的兩個半胱氨酸被丙氨酸單獨或同時取代。設(shè)計并合成帶有YY1結(jié)合位點的wt探針和帶有突變序列的探針,利用凝膠電泳遷移率實驗檢測YY1 wt和突變體蛋白與探針的結(jié)合親和力。鋅指2和3中半胱氨酸被丙氨酸取代的YY1突變體蛋白完全喪失了與wt探針的結(jié)合能力。與wt YY1蛋白相比,YY1鋅指1和4突變所產(chǎn)生的YY1突變體蛋白與wt探針結(jié)合顯著降低。2.YY1 wt和突變體表達質(zhì)粒分別與構(gòu)建的CDC6啟動子啟動Gaussia熒光素酶(Gluc)的表達報告載體共同轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中,然后對Gluc活性進行檢測。與wt YY1相比,...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 引言
    1.2 YY1基因
        1.2.1 YY1概述
        1.2.2 YY1與癌癥
        1.2.3 YY1鋅指的功能
    1.3 論文的研究目的及其研究意義
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料與實驗儀器
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 實驗儀器
        2.1.3 實驗試劑的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 載體質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.2 慢病毒的包裝與侵染
        2.2.3 細胞培養(yǎng)與瞬時轉(zhuǎn)染
        2.2.4 蛋白表達及純化
        2.2.5 圓二色性光譜實驗
        2.2.6 電泳遷移率實驗
        2.2.7 Gluc熒光素酶活性檢測
        2.2.8 Western Blot實驗
        2.2.9 細胞增殖測定
        2.2.10 實時定量PCR
        2.2.11 引物設(shè)計
3 實驗結(jié)果
    3.1 YY1蛋白與DNA結(jié)合分析
    3.2 YY1突變體的結(jié)構(gòu)分析
    3.3 YY1半胱氨酸突變體對CDC6轉(zhuǎn)錄活性的影響
    3.4 YY1雙半胱氨酸突變體對乳腺癌細胞增殖和基因表達的影響
    3.5 本章小結(jié)
討論
結(jié)論
參考文獻
附錄
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文
致謝
附件



本文編號：3938926