本研究以擬南芥(Arabidopsis thaliana)、本氏煙草(Nicontiana benthamiana)和大豆(Glycine max)為試驗材料,通過酶解法結(jié)合去除葉片下表皮的預(yù)處理,以及PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化,建立了一種操作簡單且高效的原生質(zhì)體分離和瞬時轉(zhuǎn)化方法,為目標(biāo)基因的亞細胞定位分析和基于原生質(zhì)體為受體材料進行遺傳等方面的基礎(chǔ)研究提供方法支撐。結(jié)果表明,利用上述方法, 3種植物均能獲得較高產(chǎn)量且低破損率的原生質(zhì)體,同時避免了原生質(zhì)體的純化過程。其中,擬南芥的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高,其次是大豆和煙草;并且,煙草和擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率較高,大豆較低,煙草和擬南芥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率高達50%以上,分別是大豆的3.84和3.62倍。進一步的亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn),煙草和擬南芥的原生質(zhì)體在GFP和RFP共轉(zhuǎn)定位時存在優(yōu)勢,可用于目標(biāo)基因的亞細胞定位分析。

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【部分圖文】：

圖1不同植物葉片原生質(zhì)體的分離處理

瞬時轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體水平放置在20～25°C的弱光條件下培養(yǎng)16h后,在激光共聚焦顯微鏡(LSM880,CarlZeiss)下觀察亞細胞定位并統(tǒng)計轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化效率(%)=攜帶熒光的原生質(zhì)體數(shù)目原生質(zhì)體總數(shù)×100。選取3個有代表性的視野進行統(tǒng)計,并計算平均值。觀察綠色熒光蛋白....

圖2光學(xué)顯微鏡觀察不同植物葉片的原生質(zhì)體

本研究利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,對擬南芥、煙草和大豆原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化比較分析。結(jié)果如圖3所示,同一視野條件下,擬南芥(圖3-A)和煙草(圖3-B)的多個原生質(zhì)體成功被轉(zhuǎn)化而含有GFP信號,對比而言,大豆原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率較低(圖3-C)。進一步數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(表1),擬南芥和煙....

圖3PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

為了分析上述方法分離的原生質(zhì)體功用性,將pCAMBIA1300(GFP)和pm-rbCD3-1008(RFP)質(zhì)粒分別共同轉(zhuǎn)入擬南芥(圖4-A)和煙草(圖4-B)的原生質(zhì)體,將pA7-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大豆原生質(zhì)體(圖4-C),在激光共聚焦條件下觀察亞細胞定位。結(jié)果如圖4所示,擬南....

圖4空載體在不同植物原生質(zhì)體中的亞細胞定位

圖3PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化3討論

本文編號：3927559