【背景】天蠶素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最顯著的抗菌肽,實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)為其在農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)�！灸康摹揩@得一株高效生產(chǎn)天蠶素AD的基因工程菌株。【方法】構(gòu)建重組載體pGAPZαA-CAD通過電擊轉(zhuǎn)化至PichiapastorisX33中,表達(dá)天蠶素AD基因并獲得X33/GCAD菌株;構(gòu)建重組載體pUCGAP-CAD導(dǎo)入至X33/GCAD菌株中。pGAPZαA-CAD是以博來(lái)霉素為抗性篩選標(biāo)簽被整合到P. pastoris X33的GAPDH啟動(dòng)子區(qū)域,pUCGAP-CAD是以遺傳霉素為抗性篩選標(biāo)簽被整合到P. pastoris X33的非翻譯rDNA區(qū)域,最終獲得一株高效表達(dá)天蠶素AD的酵母菌株X33/GUCAD�！窘Y(jié)果】通過質(zhì)譜分析鑒定X33/GUCAD表達(dá)的抑菌物質(zhì)為天蠶素AD,通過發(fā)酵條件的優(yōu)化,表明X33/GUCAD菌株在以甘油為碳源和以蛋白胨、酵母提取物為有機(jī)氮源的情況下具有較強(qiáng)表達(dá)天蠶素AD的能力�！窘Y(jié)論】較高的拷貝數(shù)更有利于提高天蠶素AD的產(chǎn)量,此工程菌株在后期發(fā)酵過程中穩(wěn)定性較好,適于工業(yè)化生產(chǎn)。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.1.2 主要試劑和儀器
        1.1.3 培養(yǎng)基
    1.2 重組菌株的表達(dá)
        1.2.1 重組表達(dá)載體pGAPZαA-CAD的構(gòu)建及重組菌株X33/GCAD的表達(dá)
        1.2.2 重組表達(dá)載體pUCGAP-CAD的構(gòu)建及重組菌株X33/GUCAD的表達(dá)
    1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法確定重組菌株中的基因拷貝數(shù)
    1.4 天蠶素AD的Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白電泳及質(zhì)譜鑒定
    1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化
        1.5.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇
        1.5.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中不同碳源的選擇
        1.5.3 發(fā)酵培養(yǎng)中氮源添加量?jī)?yōu)化
    1.6 固體抑菌試驗(yàn)及抗菌譜的測(cè)定
    1.7 抗菌肽生物效價(jià)的計(jì)算方法[24]
2 結(jié)果與分析
    2.1 多拷貝整合表達(dá)天蠶素AD畢赤酵母工程菌的構(gòu)建
    2.2 不同轉(zhuǎn)化子中天蠶素AD基因拷貝數(shù)的確定
    2.3 天蠶素AD的Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白膠及質(zhì)譜圖分析
    2.4 不同培養(yǎng)基、碳源以及氮源含量對(duì)天蠶素AD表達(dá)的影響
    2.5 抗菌譜的測(cè)定
3 討論與結(jié)論



本文編號(hào)：3879390