【背景】天蠶素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最顯著的抗菌肽,實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)為其在農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)中的應用奠定了基礎。【目的】獲得一株高效生產(chǎn)天蠶素AD的基因工程菌株。【方法】構建重組載體pGAPZαA-CAD通過電擊轉化至PichiapastorisX33中,表達天蠶素AD基因并獲得X33/GCAD菌株;構建重組載體pUCGAP-CAD導入至X33/GCAD菌株中。pGAPZαA-CAD是以博來霉素為抗性篩選標簽被整合到P. pastoris X33的GAPDH啟動子區(qū)域,pUCGAP-CAD是以遺傳霉素為抗性篩選標簽被整合到P. pastoris X33的非翻譯rDNA區(qū)域,最終獲得一株高效表達天蠶素AD的酵母菌株X33/GUCAD�！窘Y果】通過質譜分析鑒定X33/GUCAD表達的抑菌物質為天蠶素AD,通過發(fā)酵條件的優(yōu)化,表明X33/GUCAD菌株在以甘油為碳源和以蛋白胨、酵母提取物為有機氮源的情況下具有較強表達天蠶素AD的能力。【結論】較高的拷貝數(shù)更有利于提高天蠶素AD的產(chǎn)量,此工程菌株在后期發(fā)酵過程中穩(wěn)定性較好,適于工業(yè)化生產(chǎn)。

【文章頁數(shù)】：11 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和質粒
        1.1.2 主要試劑和儀器
        1.1.3 培養(yǎng)基
    1.2 重組菌株的表達
        1.2.1 重組表達載體pGAPZαA-CAD的構建及重組菌株X33/GCAD的表達
        1.2.2 重組表達載體pUCGAP-CAD的構建及重組菌株X33/GUCAD的表達
    1.3 實時熒光定量PCR法確定重組菌株中的基因拷貝數(shù)
    1.4 天蠶素AD的Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白電泳及質譜鑒定
    1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化
        1.5.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇
        1.5.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中不同碳源的選擇
        1.5.3 發(fā)酵培養(yǎng)中氮源添加量優(yōu)化
    1.6 固體抑菌試驗及抗菌譜的測定
    1.7 抗菌肽生物效價的計算方法[24]
2 結果與分析
    2.1 多拷貝整合表達天蠶素AD畢赤酵母工程菌的構建
    2.2 不同轉化子中天蠶素AD基因拷貝數(shù)的確定
    2.3 天蠶素AD的Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白膠及質譜圖分析
    2.4 不同培養(yǎng)基、碳源以及氮源含量對天蠶素AD表達的影響
    2.5 抗菌譜的測定
3 討論與結論



本文編號：3879390