多價(jià)相互作用介導(dǎo)的液-液相分離(liquid-liquid phase separation,LLPS)能夠驅(qū)動(dòng)應(yīng)激顆粒、核仁和紡錘體等多個(gè)無膜區(qū)室形成。而且,相分離的異常與多種疾病密切相關(guān)。信號(hào)體(signalosomes)參與信號(hào)的起始和傳遞,其正確組裝對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。然而,目前對(duì)于信號(hào)體的組裝機(jī)制還知之甚少。最近研究表明,相分離參與信號(hào)分子成簇,調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)胰島素和IGF-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白,IRS-1(insulin receptor substrate 1,IRS-1),含有內(nèi)部無序區(qū)域(intrinsically disordered region,IDR),能夠在體外和細(xì)胞內(nèi)驅(qū)動(dòng)相分離。進(jìn)一步,我們發(fā)現(xiàn)IRS-1存在分子間相互作用并鑒定了對(duì)于相分離液滴形成必要的關(guān)鍵區(qū)域HIR(homophilic interaction region,HIR)。而且,IRS-1能夠作為支架蛋白通過相分離形成無膜信號(hào)體,招募下游信號(hào)蛋白,調(diào)控IGF-1信號(hào)傳遞。重要的是,IRS-1還能...

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
中文摘要
Abstract
縮略詞表
1 引言
2 材料與方法
    2.1 主要儀器
    2.2 主要試劑
        2.2.1 試劑和耗材
        2.2.2 抗體
        2.2.3 質(zhì)粒
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
        2.3.2 細(xì)胞凍存
        2.3.3 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.3.4 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.5 質(zhì)粒的抽提
        2.3.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        2.3.7 siRNA敲降
        2.3.8 GST融合蛋白制備
        2.3.9 GST pull-down
        2.3.10 內(nèi)源蛋白免疫共沉淀(Co-IP)
        2.3.11 外源蛋白免疫共沉淀(Co-IP)
        2.3.12 蛋白免疫印跡(Western blot)
        2.3.13 免疫熒光
        2.3.14 FLAG-IRS-1 蛋白純化
        2.3.15 體外相分離
        2.3.16 GDP和 GTPγS結(jié)合實(shí)驗(yàn)
        2.3.17 亞細(xì)胞器組分分離
        2.3.18 光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)(FRAP)
        2.3.19 3D渲染和液滴參數(shù)計(jì)算
        2.3.20 蛋白質(zhì)內(nèi)部無序區(qū)域預(yù)測和氨基酸含量比例
        2.3.21 數(shù)據(jù)做圖和統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果
    3.1 IRS-1驅(qū)動(dòng)液-液相分離
        3.1.1 IRS-1在細(xì)胞內(nèi)形成液滴樣結(jié)構(gòu)
        3.1.2 IRS-1液滴樣結(jié)構(gòu)具有液滴樣特性
        3.1.3 IRS-1在體外驅(qū)動(dòng)相分離
    3.2 IRS-1通過分子間相互作用驅(qū)動(dòng)相分離液滴形成
        3.2.1 IRS-1 含有內(nèi)部無序區(qū)域(IDR)
        3.2.2 IRS-1300-600區(qū)域?qū)τ谙喾蛛x液滴形成是必要的
        3.2.3 IRS-1 HIR介導(dǎo)IRS-1 的分子間相互作用
    3.3 IRS-1通過相分離形成無膜信號(hào)體
        3.3.1 IRS-1 相分離液滴能夠響應(yīng)IGF-1 刺激
        3.3.2 IRS-1通過相分離招募下游信號(hào)蛋白
        3.3.3 酪氨酸殘基調(diào)控IRS-1相分離液滴的形成
    3.4 IRS-1 相分離對(duì)于IGF-1 信號(hào)傳遞是必要的
    3.5 IRS-1無膜信號(hào)體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用
        3.5.1 IRS-1無膜信號(hào)體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成動(dòng)態(tài)接觸
        3.5.2 VAPB-IRS-1 相互作用促進(jìn)IRS-1 無膜信號(hào)體與ER互作
        3.5.3 IRS-1 600-800 區(qū)域介導(dǎo)IRS-1-VAPB相互作用
    3.6 VAPB調(diào)控IRS-1 的周轉(zhuǎn)和表達(dá)水平
        3.6.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激削弱IRS-1相分離
        3.6.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激削弱IRS-1和VAPB的共定位
        3.6.3 VAPB通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控IRS-1 表達(dá)水平
        3.6.4 VAPB調(diào)控細(xì)胞中IRS-1 的周轉(zhuǎn)
        3.6.5 脂滴誘導(dǎo)物削弱IRS-1 相分離和VAPB-IRS-1 共定位
        3.6.6 ALS疾病相關(guān)VAPBP56S突變體削弱IRS-1 表達(dá)水平
    3.7 VAPB是 Rab5 的效應(yīng)物蛋白
        3.7.1 VAPB通過MSP結(jié)構(gòu)域與Rab5 相互作用
        3.7.2 VAPB-Rab5 相互作用形成ER-內(nèi)體互作
        3.7.3 VAPB與活化的Rab5 有更強(qiáng)的相互作用
    3.8 Rab5 調(diào)控IRS-1 無膜信號(hào)體與ER互作
        3.8.1 Rab5與IRS-1、VAPB共定位
        3.8.2 Rab5 調(diào)控VAPB與 IRS-1 相互作用
4 討論
參考文獻(xiàn)
綜述 生物相分離的形成機(jī)制及其翻譯后修飾調(diào)控的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
作者簡歷及博士期間科研成果



本文編號(hào)：3875627