多價相互作用介導的液-液相分離(liquid-liquid phase separation,LLPS)能夠驅(qū)動應激顆粒、核仁和紡錘體等多個無膜區(qū)室形成。而且,相分離的異常與多種疾病密切相關。信號體(signalosomes)參與信號的起始和傳遞,其正確組裝對于信號轉(zhuǎn)導至關重要。然而,目前對于信號體的組裝機制還知之甚少。最近研究表明,相分離參與信號分子成簇,調(diào)控信號轉(zhuǎn)導。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)胰島素和IGF-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)信號通路中的關鍵節(jié)點蛋白,IRS-1(insulin receptor substrate 1,IRS-1),含有內(nèi)部無序區(qū)域(intrinsically disordered region,IDR),能夠在體外和細胞內(nèi)驅(qū)動相分離。進一步,我們發(fā)現(xiàn)IRS-1存在分子間相互作用并鑒定了對于相分離液滴形成必要的關鍵區(qū)域HIR(homophilic interaction region,HIR)。而且,IRS-1能夠作為支架蛋白通過相分離形成無膜信號體,招募下游信號蛋白,調(diào)控IGF-1信號傳遞。重要的是,IRS-1還能...

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學位級別】：博士

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致謝
中文摘要
Abstract
縮略詞表
1 引言
2 材料與方法
    2.1 主要儀器
    2.2 主要試劑
        2.2.1 試劑和耗材
        2.2.2 抗體
        2.2.3 質(zhì)粒
    2.3 實驗方法
        2.3.1 細胞培養(yǎng)及傳代
        2.3.2 細胞凍存
        2.3.3 細胞復蘇
        2.3.4 質(zhì)粒構建
        2.3.5 質(zhì)粒的抽提
        2.3.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        2.3.7 siRNA敲降
        2.3.8 GST融合蛋白制備
        2.3.9 GST pull-down
        2.3.10 內(nèi)源蛋白免疫共沉淀(Co-IP)
        2.3.11 外源蛋白免疫共沉淀(Co-IP)
        2.3.12 蛋白免疫印跡(Western blot)
        2.3.13 免疫熒光
        2.3.14 FLAG-IRS-1 蛋白純化
        2.3.15 體外相分離
        2.3.16 GDP和 GTPγS結合實驗
        2.3.17 亞細胞器組分分離
        2.3.18 光漂白恢復實驗(FRAP)
        2.3.19 3D渲染和液滴參數(shù)計算
        2.3.20 蛋白質(zhì)內(nèi)部無序區(qū)域預測和氨基酸含量比例
        2.3.21 數(shù)據(jù)做圖和統(tǒng)計分析
3 結果
    3.1 IRS-1驅(qū)動液-液相分離
        3.1.1 IRS-1在細胞內(nèi)形成液滴樣結構
        3.1.2 IRS-1液滴樣結構具有液滴樣特性
        3.1.3 IRS-1在體外驅(qū)動相分離
    3.2 IRS-1通過分子間相互作用驅(qū)動相分離液滴形成
        3.2.1 IRS-1 含有內(nèi)部無序區(qū)域(IDR)
        3.2.2 IRS-1300-600區(qū)域?qū)τ谙喾蛛x液滴形成是必要的
        3.2.3 IRS-1 HIR介導IRS-1 的分子間相互作用
    3.3 IRS-1通過相分離形成無膜信號體
        3.3.1 IRS-1 相分離液滴能夠響應IGF-1 刺激
        3.3.2 IRS-1通過相分離招募下游信號蛋白
        3.3.3 酪氨酸殘基調(diào)控IRS-1相分離液滴的形成
    3.4 IRS-1 相分離對于IGF-1 信號傳遞是必要的
    3.5 IRS-1無膜信號體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用
        3.5.1 IRS-1無膜信號體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成動態(tài)接觸
        3.5.2 VAPB-IRS-1 相互作用促進IRS-1 無膜信號體與ER互作
        3.5.3 IRS-1 600-800 區(qū)域介導IRS-1-VAPB相互作用
    3.6 VAPB調(diào)控IRS-1 的周轉(zhuǎn)和表達水平
        3.6.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激削弱IRS-1相分離
        3.6.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激削弱IRS-1和VAPB的共定位
        3.6.3 VAPB通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控IRS-1 表達水平
        3.6.4 VAPB調(diào)控細胞中IRS-1 的周轉(zhuǎn)
        3.6.5 脂滴誘導物削弱IRS-1 相分離和VAPB-IRS-1 共定位
        3.6.6 ALS疾病相關VAPBP56S突變體削弱IRS-1 表達水平
    3.7 VAPB是 Rab5 的效應物蛋白
        3.7.1 VAPB通過MSP結構域與Rab5 相互作用
        3.7.2 VAPB-Rab5 相互作用形成ER-內(nèi)體互作
        3.7.3 VAPB與活化的Rab5 有更強的相互作用
    3.8 Rab5 調(diào)控IRS-1 無膜信號體與ER互作
        3.8.1 Rab5與IRS-1、VAPB共定位
        3.8.2 Rab5 調(diào)控VAPB與 IRS-1 相互作用
4 討論
參考文獻
綜述 生物相分離的形成機制及其翻譯后修飾調(diào)控的研究進展
    參考文獻
作者簡歷及博士期間科研成果



本文編號：3875627