甲型流感病毒作為主要的病源,每年都會(huì)引起不同規(guī)模的流感疫情。NS1蛋白是甲型流感病毒主要的毒性蛋白,在病毒感染過程中發(fā)揮著重要的作用。實(shí)驗(yàn)室在前期已經(jīng)證明甲型流感病毒NS1蛋白與宿主細(xì)胞NOLC1蛋白存在特異性的相互作用,并確定了兩種蛋白的特異性位點(diǎn),然而對(duì)于NS1與NOLC1蛋白相互作用相關(guān)機(jī)制與影響尚不清楚。本文利用感染性克隆技術(shù)構(gòu)建了H1N1(PR8)野生型(WT)病毒的八質(zhì)粒系統(tǒng),并根據(jù)H1N1的NS1蛋白與NOLC1蛋白的序列特異性作用位點(diǎn)(125D與200R)構(gòu)建了三套突變型H1N1型病毒的感染性克隆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。深入研究了NS1蛋白與NOLC1相互作用對(duì)流感病毒H1N1復(fù)制的影響。主要工作如下:1、通過構(gòu)建H1N1甲型禽流感病毒關(guān)于感染性克隆的PHW2000雙轉(zhuǎn)錄八質(zhì)粒系統(tǒng)與NS1突變的三套系統(tǒng),成功拯救并獲得了四種流感病毒毒株:H1N1(WT)、H1N1-125、H1N1-200、H1N1-125/200;同時(shí)構(gòu)建并篩選出A549的NOLC1蛋白敲降穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(pLKO.1-TRC-NOLC1);檢測(cè)出雞胚擴(kuò)增的流感病毒H1N1(PR8)的病毒滴度TCID50/mL在5.6...

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 甲型流感病毒
        1.1.1 背景
        1.1.2 甲型流感病毒的病毒學(xué)特點(diǎn)
        1.1.3 甲型流感病毒NS1蛋白簡(jiǎn)介
        1.1.4 甲型流感病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制
    1.2 人核仁磷酸化NOLC1蛋白簡(jiǎn)介
    1.3 RNA干擾技術(shù)
        1.3.1 RNAi背景
        1.3.2 RNA干擾技術(shù)機(jī)制
    1.4 實(shí)驗(yàn)研究目的及意義
第二章 H1N1甲型流感病毒八質(zhì)粒系統(tǒng)的建立
    2.1 前言
    2.2 材料與試劑
        2.2.1 主要材料
        2.2.2 主要試劑
    2.3 溶液配制
    2.4 儀器和耗材
    2.5 實(shí)驗(yàn)方法
        2.5.1 PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS1 雙轉(zhuǎn)錄八質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建
        2.5.2 NS1-125、NS1-200 兩單點(diǎn)與NS1-125/200 雙點(diǎn)NS1 突變?nèi)|(zhì)粒構(gòu)建
    2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
第三章 H1N1甲型流感病毒的拯救與驗(yàn)證
    3.1 前言
    3.2 材料與試劑
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
        3.2.2 主要試劑
    3.3 溶液配制
    3.4 儀器和耗材
    3.5 實(shí)驗(yàn)方法
        3.5.1 239T與MDCK細(xì)胞復(fù)蘇
        3.5.2 239T與MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代
        3.5.3 用Lipofectamine?3000 進(jìn)行八質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        3.5.4 SPF雞胚接種
        3.5.5 收集雞胚尿囊液的擴(kuò)增的病毒樣品
        3.5.6 HA血凝初步檢測(cè)驗(yàn)證
        3.5.7 病毒滴度TCID50測(cè)定
        3.5.8 拯救病毒對(duì)A549細(xì)胞感染的病變(CPE)檢測(cè)
        3.5.9 絕對(duì)定量法(RT)檢測(cè)獲得拯救病毒的拷貝數(shù)
    3.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.6.1 HA血凝初步檢測(cè)驗(yàn)證
        3.6.2 病毒滴度TCID50測(cè)定結(jié)果
        3.6.3 病毒感染A549細(xì)胞的病變(CPE)檢測(cè)結(jié)果
        3.6.4 絕對(duì)定量法(RT)檢測(cè)獲得拯救病毒的拷貝數(shù)結(jié)果
        3.6.5 綜合結(jié)果討論
第四章 A549細(xì)胞株NOLC1蛋白的敲降慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建
    4.1 前言
    4.2 材料與試劑
        4.2.1 試材準(zhǔn)備
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 溶液配制
        4.2.4 儀器及耗材
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 慢病毒干擾載體p LKO.1-TRC--NOLC1
        4.3.2 嘌呤霉素工作濃度的確定
        4.3.3 慢病毒包裝以及穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選
        4.3.4 WB檢測(cè)A549 細(xì)胞及其敲降表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中NOLC1 蛋白含量
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 嘌呤霉素工作濃度的確定
        4.4.2 WB檢測(cè)A549 及其敲降表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中NOLC1 蛋白含量
    4.5 結(jié)果討論
第五章 H1N1 甲型流感病毒感染A549對(duì)NOLC1 的影響
    5.1 前言
    5.2 材料與試劑
        5.2.1 試材準(zhǔn)備
        5.2.2 主要試劑
        5.2.3 溶液配制
        5.2.4 儀器和材料
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        5.3.2 WT、125、200、125/200四種病毒感染與樣品收集
        5.3.3 細(xì)胞樣品總RNA提取
        5.3.4 一步法反轉(zhuǎn)錄
        5.3.5 RT-PCR熒光定量檢測(cè)NOLC1 基因轉(zhuǎn)錄
        5.3.6 Western Blot技術(shù)檢測(cè)正常A549中NOLC1 蛋白含量
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 野生型病毒感染A549細(xì)胞NOLC1蛋白含量的變化情況
        5.4.2 四種病毒感染A549細(xì)胞對(duì)NOLC1蛋白的影響比較
        5.4.3 病毒感染A549細(xì)胞時(shí)間點(diǎn)NOLC1基因轉(zhuǎn)錄水平
    5.5 結(jié)果討論
第六章 NS1與NOLC1 蛋白的相互作用對(duì)HIN1 病毒復(fù)制的影響
    6.1 前言
    6.2 材料與試劑
        6.2.1 試材準(zhǔn)備
        6.2.2 主要試劑
        6.2.3 溶液配制
        6.2.4 儀器和材料
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        6.3.2 WT、125、200、125/200四種病毒感染與樣品收集
        6.3.3 樣品總RNA提取
        6.3.4 兩步法逆轉(zhuǎn)錄與RTPCR檢測(cè)樣品
        6.3.5 RT-PCR熒光定量檢測(cè)病毒總RNA、v RNA、c RNA
    6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.4.1 四種病毒感染后時(shí)間點(diǎn)內(nèi)病毒RNA的拷貝數(shù)
        6.4.2 四種病毒感染后時(shí)間點(diǎn)內(nèi)病毒vRNA的拷貝數(shù)
        6.4.3 四種病毒感染后時(shí)間點(diǎn)內(nèi)病毒cRNA的拷貝數(shù)
        6.4.4 四種病毒感染后時(shí)間點(diǎn)內(nèi)病毒滴度變化
    6.5 結(jié)果討論
第七章 結(jié)論與展望
致謝
參考文獻(xiàn)
研究生期間發(fā)表的論文及參加科研情況
附錄一 SPF雞胚檢測(cè)報(bào)告
附錄二 試劑及配置一覽表一
附錄三 試劑及配置一覽表二
附錄四 主要儀器與耗材一覽表
附錄五 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖一覽表



本文編號(hào)：3873170