發(fā)布時(shí)間：2023-12-10 16:43

　　水稻是世界上重要的糧食作物,也是單子葉模式植物。水稻基因功能的研究對(duì)提高水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。CRISPR/Cas9技術(shù)是一種非常重要的基因編輯技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)編輯,它在作物遺傳改良和基因功能研究中有著重要作用。目前,CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻中的應(yīng)用非常普遍,許多實(shí)驗(yàn)室通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的方法對(duì)水稻中的基因進(jìn)行了精確編輯。然而,大多數(shù)技術(shù)會(huì)將來(lái)自農(nóng)桿菌的T-DNA整合到植物基因組中,這會(huì)導(dǎo)致可遺傳的外源DNA元件轉(zhuǎn)化到宿主植物中。在這個(gè)課題中,我們研究了一種有潛力的用于快速獲得Cas9-free水稻植株的方法。我們回顧農(nóng)桿菌相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),農(nóng)桿菌的毒蛋白基因VirD2的ω域介導(dǎo)外源DNA整合到植物基因組,而VirD5基因的缺失影響農(nóng)桿菌的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化,但不影響其瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。因此,我們?nèi)コ宿r(nóng)桿菌EHA105的VirD2基因的ω結(jié)構(gòu)域,然后,與VirD5基因缺失的農(nóng)桿菌菌株一起介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)化,使用了3種測(cè)試方案獲得Cas9-free的突變水稻植株。方案一中,我們?cè)谒窘M培的抗性篩選過(guò)程中分了3種情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn):第一種是兩次篩選時(shí)都加入潮霉素處理,第二種是第一次篩選...

【文章頁(yè)數(shù)】：99 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 前言
    1.1 研究問(wèn)題的由來(lái)
    1.2 文獻(xiàn)綜述
        1.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
            1.2.1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的起源
            1.2.1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制
            1.2.1.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在研究與育種中的應(yīng)用
            1.2.1.4 Cas9-free研究進(jìn)展
            1.2.1.5 基因編輯作物的商業(yè)應(yīng)用
        1.2.2 根癌農(nóng)桿菌
            1.2.2.1 根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒
            1.2.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率
            1.2.2.3 根癌農(nóng)桿菌毒力蛋白VirD2與VirD5的研究進(jìn)展
    1.3 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和載體
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pJQ-mVirD2
        2.2.2 根癌農(nóng)桿菌VirD2缺失突變體的篩選
        2.2.3 農(nóng)桿菌突變體電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備
        2.2.4 CRISPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        2.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻轉(zhuǎn)化
        2.2.6 突變體轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性檢測(cè)
            2.2.6.1 水稻總DNA抽提
            2.2.6.2 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性檢測(cè)
        2.2.7 突變體基因型檢測(cè)
3 結(jié)果與分析
    3.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pJQ-mVirD2
        3.1.1 目的基因的擴(kuò)增
        3.1.2 載體pJQ200SK的酶切
        3.1.3 載體的連接和轉(zhuǎn)化
        3.1.4 菌液PCR檢測(cè)
        3.1.5 測(cè)序
    3.2 根癌農(nóng)桿菌VirD2缺失突變體的篩選
        3.2.1 抗性篩選
        3.2.2 蔗糖篩選
    3.3 方案一結(jié)果分析
        3.3.1 方案一CRISPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        3.3.2 方案一水稻組培實(shí)驗(yàn)
        3.3.3 方案一轉(zhuǎn)基因T0代水稻植株鑒定分析
    3.4 方案二結(jié)果分析
        3.4.1 方案二CRISPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        3.4.2 方案二水稻組培實(shí)驗(yàn)
        3.4.3 方案二轉(zhuǎn)基因T0代水稻植株鑒定分析
    3.5 方案三結(jié)果分析
        3.5.1 方案三CRISPR質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        3.5.2 方案三水稻組培實(shí)驗(yàn)
        3.5.3 方案三轉(zhuǎn)基因T0代水稻植株鑒定分析
4 討論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號(hào)：3872742