2-氧化戊二酸依賴型氧化酶家族是自然界中第二大氧化酶家族。該家族中的一大類酶參與植物類黃酮的次級(jí)代謝過程。類黃酮化合物已被證實(shí)具有多種藥理活性。結(jié)合已有研究,本課題重點(diǎn)著眼于發(fā)掘高效新穎黃酮醇合酶。以富含黃酮類化合物的植物虎眼萬年青(Ornithogalum caudatum Jacq)為植物材料,從中挖掘得到了一個(gè)具有鐵不依賴型二氫黃酮3β羥化酶功能的黃酮醇合酶家族。1、虎眼萬年青黃酮醇合酶基因的克隆及表達(dá)轉(zhuǎn)錄組序列挖掘獲得可能編碼黃酮醇合酶的13條候選基因序列;提取植物總RNA;以RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,通過巢式克隆得到13條相似基因。成功構(gòu)建了其中10條基因的原核表達(dá)載體,并完成了其中6個(gè)重組蛋白的可溶性表達(dá)工作。2、虎眼萬年青黃酮醇合酶家族的功能表征通過構(gòu)建體外酶促反應(yīng)體系,以二氫黃酮醇香橙素為底物驗(yàn)證重組蛋白的黃酮醇合酶功能,以二氫黃酮柚皮素為底物驗(yàn)證其二氫黃酮3β羥化酶功能。獲得兩個(gè)具有體外活性的虎眼萬年青黃酮醇合酶,將其分別命名為OcFLS1和OcFLS2。對(duì)于OcFLS1和OcFLS2又選擇了 17個(gè)黃酮類的化合物進(jìn)行了功能寬泛性的探究,證明其僅對(duì)二氫黃酮和二...

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 2-氧化戊二酸依賴型氧化酶家族的研究現(xiàn)狀
        1.1.1 2-氧化戊二酸依賴型氧化酶家族的分布
        1.1.2 2-氧化戊二酸依賴型氧化酶的結(jié)構(gòu)與機(jī)理
        1.1.3 植物中2-氧化戊二酸依賴型氧化酶的分類
    1.2 黃酮醇合酶與二氫黃酮3β羥化酶
        1.2.1 具有生物活性的黃酮醇類化合物
        1.2.2 黃酮醇合酶是黃酮醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶
        1.2.3 黃酮醇合酶和二氫黃酮3β羥化酶的研究進(jìn)展
    1.3 富含黃酮類化合物的植物虎眼萬年青
第二章 實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料、試劑與儀器
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植株品種
        2.1.2 菌株與質(zhì)粒
    2.2 酶、試劑盒與相關(guān)生化試劑
        2.2.1 酶與試劑盒
        2.2.2 生化試劑
    2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.4 實(shí)驗(yàn)常用試劑和溶液配方
        2.4.1 核酸電泳緩沖液
        2.4.2 核酸電泳瓊脂糖凝膠
        2.4.3 LB培養(yǎng)基
        2.4.4 SDS-PAGE蛋白電泳相關(guān)溶液
        2.4.5 蛋白純化相關(guān)溶液
第三章 虎眼萬年青中黃酮醇合酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    引言
    3.1 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1.1 O.caudatum轉(zhuǎn)錄組測序
        3.1.2 植物總RNA的提取
        3.1.3 全cDNA的合成
        3.1.4 黃酮醇合酶基因OcFLSs的克隆
        3.1.5 OcFLSs生物信息學(xué)分析
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.1 O.caudatum轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析
        3.2.2 植物組織RNA的提取結(jié)果
        3.2.3 OcFLSs基因克隆結(jié)果
        3.2.4 OcFLSs生物信息學(xué)分析
    3.3 本章小結(jié)
第四章 虎眼萬年青中黃酮醇合酶基因的異源表達(dá)及純化
    引言
    4.1 實(shí)驗(yàn)方法
        4.1.1 OcFLSs原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.1.2 OcFLSs的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測
        4.1.3 OcFLSs的純化及濃縮
        4.1.4 OcFLSs蛋白定量
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.2.1 構(gòu)建含OcFLSs基因的表達(dá)載體
        4.2.2 OcFLSs的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果
        4.2.3 OcFLSs純化濃縮及定量結(jié)果
第五章 雙功能黃酮醇合酶OcFLSs的功能表征
    引言
    5.1 實(shí)驗(yàn)方法
        5.1.1 黃酮醇合酶活性的測定
        5.1.2 二氫黃酮3β羥化酶活性的測定
        5.1.3 輔因子對(duì)活性的影響
        5.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)活性的影響
        5.1.5 反應(yīng)pH對(duì)活性的影響
        5.1.6 二價(jià)金屬離子對(duì)活性的影響
        5.1.7 雙功能OcFLSs相關(guān)酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定
        5.1.8 OcFLSs功能寬泛性研究
        5.1.9 OcFLSs雙功能體外連續(xù)催化反應(yīng)能力探索
        5.1.10 OcFLSs表達(dá)模式分析
        5.1.11 OcFLSs結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.2.1 OcFLSs黃酮醇合酶功能的驗(yàn)證
        5.2.2 OcFLSs二氫黃酮3β羥化酶功能的驗(yàn)證
        5.2.3 OcFLSs是具有鐵不依賴型F3H活性的新型雙功能黃酮醇合酶家族
        5.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)活性的影響
        5.2.5 反應(yīng)pH對(duì)活性的影響
        5.2.6 二價(jià)金屬離子對(duì)活性的影響
        5.2.7 雙功能OcFLSs相關(guān)酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)
        5.2.8 OcFLSs功能寬泛性研究結(jié)果
        5.2.9 OcFLSs雙功能體外連續(xù)催化反應(yīng)能力
        5.2.10 OcFLSs表達(dá)模式分析結(jié)果
        5.2.11 OcFLSs結(jié)構(gòu)域及序列一致性分析
        5.2.12 OcFLSs系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析
第六章 總結(jié)與展望
    6.1 研究意義與創(chuàng)新點(diǎn)
    6.2 課題進(jìn)展與展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
個(gè)人簡介



本文編號(hào)：3860035