參考大豆疫霉的CRISPR/Cas9基因組編輯技術體系,針對荔枝霜疫霉RXLR效應蛋白編碼基因Pl Avh133設計了20 bp的sgRNA靶向序列,結合同源替換的方式對該基因進行敲除。利用聚乙二醇(PEG)介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,共獲得了58個具有G418抗性的轉(zhuǎn)化子,通過PCR和測序分析證明其中5個轉(zhuǎn)化子的Pl Avh133基因被敲除,敲除效率約為8.6%。熒光定量PCR分析證實Pl Avh133敲除突變體中該基因不表達。本研究結果為荔枝霜疫霉的基因功能研究提供了重要的技術基礎。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 供試菌株
    1.2 供試培養(yǎng)基及試劑
    1.3 載體及其構建
    1.4 PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        1.4.1 菌絲收集
        1.4.2 原生質(zhì)體制備
        1.4.3 轉(zhuǎn)化
    1.5 轉(zhuǎn)化子的驗證
        1.5.1 PCR驗證
        1.5.2 熒光定量PCR驗證
2 結果與分析
    2.1 荔枝霜疫霉對遺傳霉素(G418)的敏感性
    2.2 荔枝霜疫霉原生質(zhì)體酶解條件分析
    2.3 Pl Avh133的序列特征
    2.4 sgRNA靶向序列的設計
    2.5 CRISPR/Cas9敲除策略
    2.6 基因敲除及結果驗證
3 討論



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