BAP1(BRCA1-associated protein 1)最初通過酵母雙雜交被鑒定為與BRCA1(breast cancer type 1 susceptibility protein)相互作用的蛋白,編碼一種核去泛素化酶。它屬于核泛素羧基末端水解酶(UCH)家族,其已知底物包括組蛋白2A和BARD1。LKB1(Liver kinase B1)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在細胞內穩(wěn)態(tài)和腫瘤抑制中起重要作用。盡管對LKB1調控的AMPK-mTOR下游通路比較清楚,但LKB1上游調控機制長期以來并不清楚。本研究通過酵母雙雜的方法發(fā)現(xiàn)LKB1和BAP1存在相互作用,并且免疫共沉淀實驗在293T細胞內也驗證到相互作用的存在。進一步通過泛素化實驗發(fā)現(xiàn)BAP1去泛素化修飾LKB1,并且二者主要位于細胞核內,BAP1可增強LKB1的蛋白穩(wěn)定性。在幾種肺癌細胞系中BAP1與AMPK磷酸化水平具有相關性,體外磷酸化試驗提示BAP1通過LKB1刺激更多的AMPK磷酸化,這提示BAP1可通過LKB1激活AMPK。同時,敲減BAP1也顯示更高的S6K1磷酸化水平,S6K1是mTOR底物蛋白,這暗示BA...

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 BAP1研究概述
        1.1.1 BAP1功能及調控
        1.1.2 BAP1與疾病
    1.2 蛋白質泛素化與去泛素化
        1.2.1 蛋白質泛素化修飾概述
        1.2.2 蛋白質泛素化
        1.2.3 蛋白質去泛素化
    1.3 LKB1-AMPK-mTOR通路
        1.3.1 LKB1通路
        1.3.2 AMPK通路
        1.3.3 mTOR通路
第2章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 酵母雙雜交培養(yǎng)基和所用試劑
            2.1.1.1 酵母培養(yǎng)基
            2.1.1.2 酵母雙雜試劑
            2.1.1.3 酵母菌株
        2.1.2 載體構建及所用試劑
            2.1.2.1 培養(yǎng)基及抗生素
            2.1.2.2 載體構建所用酶類
            2.1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳試劑
            2.1.2.4 文章所用質粒列表
        2.1.3 蛋白純化試劑
        2.1.4 蛋白電泳及免疫印跡試劑
        2.1.5 蛋白質相互作用及泛素化試劑
        2.1.6 細胞及培養(yǎng)試劑
        2.1.7 其他試劑
        2.1.8 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 克隆載體構建
            2.2.1.1 一般克隆載體構建
            2.2.1.2 點突變克隆載體構建
            2.2.1.3 質粒DNA的小量抽提
        2.2.2 蛋白純化
            2.2.2.1 重組蛋白的檢測
            2.2.2.2 GST標簽蛋白純化
            2.2.2.3 His標簽蛋白純化
        2.2.3 酵母雙雜
        2.2.4 細胞培養(yǎng)
        2.2.5 免疫印跡
        2.2.6 GST Pull down
        2.2.7 免疫共沉淀(CO-IP)
        2.2.8 免疫沉淀及泛素化檢測
        2.2.9 體外去泛素實驗
        2.2.10 細胞免疫熒光實驗
        2.2.11 逆轉錄病毒和慢病毒包裝
        2.2.12 基于GFP competition assay系統(tǒng)的藥物篩選
        2.2.13 實時熒光定量PCR
        2.2.14 油紅O染色
        2.2.15 軟瓊脂實驗
        2.2.16 ROS分析
        2.2.17 生物學統(tǒng)計學分析方法
第3章 結果
    3.1 去泛素化酶BAP1 能夠與LKB1 蛋白相互作用
        3.1.1 酵母雙雜發(fā)現(xiàn)BAP1與LKB1 相互作用
        3.1.2 BAP1和LKB1 存在直接相互作用
    3.2 BAP1 去泛素化修飾LKB1
        3.2.1 LKB1泛素化修飾
        3.2.2 BAP1 去泛素化修飾LKB1
        3.2.3 BAP1 抑制LKB1 降解
    3.3 BAP1 通過LKB1 調控AMPK-mTOR信號通路
        3.3.1 BAP1與AMPK磷酸化水平正相關
        3.3.2 BAP1 依賴LKB1 促進AMPK磷酸化
        3.3.3 BAP1敲減細胞S6K1磷酸化水平升高
        3.3.4 BAP1 敲減細胞對PP242和Lovastatin耐受
        3.3.5 BAP1 敲減細胞抑制Lovastatin所誘導的ROS積累
    3.4 BAP1敲減細胞增強脂質合成和細胞轉化
        3.4.1 過表達BAP1抑制癌細胞生長
        3.4.2 敲減BAP1增強細胞轉化
        3.4.3 BAP1敲減細胞脂質合成關鍵基因轉錄水平升高
        3.4.4 BAP1敲減細胞增強脂質合成
第4章 討論
第5章 結論與展望
    5.1 結論
    5.2 展望
參考文獻
致謝
附錄



本文編號：3829773