PRRSV(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)主要會引起斷奶仔豬和育肥豬的呼吸道疾病以及母豬的繁殖障礙疾病,被認(rèn)為是世界上對養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的病原體之一,每年均會對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬,單股正鏈單鏈RNA病毒,基因組長度約為15.4kb,至少由11個(gè)開放閱讀框(ORF)組成。N蛋白由ORF7編碼,分子量約為15k Da,是PRRSV粒子中含量最多、免疫原性最強(qiáng)、保守性最高的蛋白之一,且宿主針對該蛋白的特異性抗體最早產(chǎn)生且存在時(shí)間較長,依據(jù)N蛋白的這些特性,N蛋白在PRRSV的檢測上具良好的診斷學(xué)意義。有研究針對N蛋白制備的單克隆抗體可區(qū)分I型和Ⅱ型毒株;利用抗N蛋白單克隆鑒定出四個(gè)抗原表位。Nsp2是PRRSV基因組中編碼最大和變異最大蛋白質(zhì),由21%到23%的基因組編碼,常作為PRRSV的監(jiān)控靶點(diǎn);Nsp2在PRRSV的復(fù)制、免疫、引發(fā)宿主細(xì)胞自噬和凋亡中發(fā)揮著重要功能。目前已有研究者以Nsp2蛋白制備的單克隆抗體可區(qū)分不同亞型的毒株,利用抗Nsp2蛋白鑒定出新的...

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
文獻(xiàn)綜述
    1 PRRSV研究進(jìn)展
        1.1 PRRSV概述
        1.2 PRRSV生物學(xué)特性
            1.2.1 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白
            1.2.2 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白
        1.3 PRRSV復(fù)制及感染機(jī)制
    2 單克隆抗體研究進(jìn)展
        2.1 單克隆抗體概述
        2.2 單克隆抗體制備技術(shù)
        2.3 單克隆抗體的應(yīng)用
        2.4 PRRSV單克隆抗體概述
試驗(yàn)研究
    第一章 PRRSV BJ3 毒株N、Nsp2 基因原核表達(dá)及高免血清的制備
        1 材料
            1.1 動物、毒株、菌種和質(zhì)粒
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 攜帶PRRSV N、Nsp2 基因克隆載體的構(gòu)建
                2.1.1 引物
                2.1.2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄
                2.1.3 目的片段的PCR
                2.1.4 純化、連接與轉(zhuǎn)化
                2.1.5 克隆質(zhì)粒的篩選
            2.2 攜帶PRRSV N、Nsp2 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
                2.2.1 目的基因PCR
                2.2.2 純化、酶切、連接與轉(zhuǎn)化
                2.2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的篩選
            2.3 重組蛋白的原核表達(dá)與條件優(yōu)化
                2.3.1 重組蛋白的原核表達(dá)
                2.3.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化
                2.3.3 重組蛋白的純化與鑒定
            2.4 高免血清制備
                2.4.1 重組蛋白濃度的測定
                2.4.2 動物免疫與血清收集
                2.4.3 高免血清效價(jià)測定
                2.4.4 高免血清Western blotting鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 攜帶PRRSV N、NSP2 基因克隆載體的構(gòu)建結(jié)果
                3.1.1 目的基因PCR結(jié)果
                3.1.2 克隆質(zhì)粒的篩選結(jié)果
            3.2 攜帶PRRSV N、NSP2 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果
                3.2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒篩選結(jié)果
                3.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切結(jié)果
            3.3 重組蛋白的原核表達(dá)與條件優(yōu)化結(jié)果
                3.3.1 重組蛋白的原核表達(dá)結(jié)果
                3.3.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果
                3.3.3 重組蛋白的純化與鑒定
            3.4 高免血清制備結(jié)果
                3.4.1 高免血清效價(jià)測定結(jié)果
                3.4.2 高免血清Western blotting鑒定結(jié)果
        4 討論
    第二章 PRRSV BJ3 毒株N和 Nsp2 蛋白單克隆抗體的制備
        1 材料
            1.1 主要實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞和毒株
            1.2 主要試劑
        2 方法
            2.1 單克隆抗體ELISA檢測方法的建立
            2.2 PRRSV BJ3 毒株N和 Nsp2 蛋白單克隆抗體的制備
                2.2.1 動物免疫
                2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
                2.2.3 細(xì)胞融合
                2.2.4 雜交瘤細(xì)胞的篩選
            2.3 單克隆抗體的鑒定
                Western blotting鑒定
            2.4 單克隆抗體腹水的制備
            2.5 單克隆抗體穩(wěn)定性的鑒定
            2.6 單克隆抗體的應(yīng)用
                2.6.1 Western blotting鑒定
                2.6.2 IFA鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 單克隆抗體ELISA檢測方法建立結(jié)果
            3.2 PRRSV BJ3 毒株N和 Nsp2 蛋白單克隆抗體的制備
                3.2.1 細(xì)胞融合結(jié)果
                3.2.2 雜交瘤細(xì)胞的篩選結(jié)果
            3.3 單克隆抗體的鑒定結(jié)果
                Western blotting鑒定結(jié)果
            3.4 單克隆抗體腹水效價(jià)結(jié)果
            3.5 單克隆抗體穩(wěn)定性鑒定結(jié)果
            3.6 單克隆抗體應(yīng)用結(jié)果
                3.6.1 Western blotting鑒定結(jié)果
                3.6.2 IFA鑒定結(jié)果
        4 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄一 相關(guān)培養(yǎng)基、溶液及試劑的配制
附錄二 碩士研究生期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號：3817248