近年來,CRISPR已成為對抗外源逆轉(zhuǎn)錄病毒病原體和器官移植中滅活內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的重要且有前途的工具。CRISPR-Cas系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated systems)是細(xì)菌及古生菌產(chǎn)生和進化的抵御外來遺傳物質(zhì)入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng),通過形成cr RNA(CRISPR RNA)-效應(yīng)蛋白復(fù)合物,識別并破壞特定的外源序列,比如噬菌體病毒和外源DNA,某些情況下為RNA。基于該系統(tǒng)的特性,現(xiàn)已開發(fā)出一系列高效的基因編輯工具,被廣泛應(yīng)用于對各宿主基因組進行編輯。CRISPR-Cas12a蛋白,屬于CRISPR核酸內(nèi)切酶家族的2類V型蛋白,缺乏HNH結(jié)構(gòu)域,具有單個Ruv C核酸酶結(jié)構(gòu)域和一個推定的Nuc結(jié)構(gòu)域,分別負(fù)責(zé)兩條DNA鏈的切割。Cas12a蛋白同時具有DNA和RNA核酸酶活性,可實現(xiàn)對多個基因的同時編輯,常在細(xì)菌、植物和哺乳動物細(xì)胞中調(diào)節(jié)異源DNA編輯。2類VI型CRISPR-Cas13效應(yīng)蛋白,具有特異地靶向和切割單鏈RNA而不是雙鏈DNA底物的獨特能力。...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 緒論
    1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)
        1.1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機制
        1.1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的分類及應(yīng)用現(xiàn)狀
    1.2 CRISPR-Cas12a:高效的DNA編輯工具
        1.2.1 CRISPR-Cas12a蛋白的作用特點
        1.2.2 CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的應(yīng)用研究
    1.3 CRISPR-Cas13a:靶向RNA的 CRISPR效應(yīng)蛋白
        1.3.1 CRISPR-Cas13a蛋白的作用特點
        1.3.2 CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的應(yīng)用研究
    1.4 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與逆轉(zhuǎn)錄病毒
        1.4.1 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與逆轉(zhuǎn)錄病毒的相似性
        1.4.2 CRISPR技術(shù)抑制/干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究
    1.5 本研究的目的意義及主要內(nèi)容
2 裂殖酵母中CRISPR-Cas12a基因編輯系統(tǒng)的實施和優(yōu)化
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 引物、質(zhì)粒和菌株
        2.2.2 試劑和儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 裂殖酵母的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)及生長速率的測定
        2.3.2 靶向MEL1 基因的Cas12a系統(tǒng)構(gòu)建
        2.3.3 donor DNA的獲取
    2.4 實驗結(jié)果與分析
        2.4.1 整合表達Fn Cas12a和 Lb Cas12a蛋白對裂殖酵母影響
        2.4.2 在裂殖酵母中實施CRISPR-Cas12a編輯系統(tǒng)
        2.4.3 優(yōu)化裂殖酵母中CRISPR-Cas12a系統(tǒng)
3 利用CRISPR-Cas12a編輯系統(tǒng)干擾裂殖酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tf1 的轉(zhuǎn)座
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 引物,質(zhì)粒和菌株
        3.2.2 試劑和儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 含有人工內(nèi)含子的Tf1逆轉(zhuǎn)座報告系統(tǒng)的構(gòu)建
        3.3.2 靶向NEO基因的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)構(gòu)建
        3.3.3 裂殖酵母逆轉(zhuǎn)座子Tf1轉(zhuǎn)座效率的測定
    3.4 實驗結(jié)果與分析
        3.4.1 構(gòu)建Tf1轉(zhuǎn)座報告系統(tǒng),用于裂殖酵母的轉(zhuǎn)座干擾分析
        3.4.2 CRISPR-Cas12a干擾Tf1 逆轉(zhuǎn)座且仍有殘留的轉(zhuǎn)座活性
        3.4.3 通過延長cr RNA靶向作用,CRISPR-Cas12a可完全消除Tf1 轉(zhuǎn)座活性
4 利用CRISPR-Cas13a編輯系統(tǒng)干擾裂殖酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tf1 的轉(zhuǎn)座
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 引物,質(zhì)粒和菌株
        4.2.2 試劑和儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 靶向Tf1 轉(zhuǎn)錄本的CRISPR-Cas13a系統(tǒng)構(gòu)建
        4.3.2 裂殖酵母逆轉(zhuǎn)座子Tf1轉(zhuǎn)座效率的測定
    4.4 實驗結(jié)果與分析
        4.4.1 CRISPR-Cas13a靶向Tf1 RNA中間體干擾Tf1 逆轉(zhuǎn)座
        4.4.2 Tf1 轉(zhuǎn)錄本激活Cas13a不會誘導(dǎo)裂殖酵母細(xì)胞生長停滯
5 總結(jié)與展望
    5.1 全文總結(jié)
    5.2 展望
參考文獻
附錄A 基本實驗操作
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
致謝



本文編號：3815420