在囊泡循環(huán)運(yùn)輸過(guò)程中,小G蛋白Arf6/ARF-6是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)體上磷脂酰肌醇4,5-二磷酸的一個(gè)決定性因子。為了進(jìn)一步了解ARF-6的分子調(diào)節(jié)過(guò)程,我們?cè)谛沱愲[桿線蟲中展開(kāi)了對(duì)ARF-6結(jié)合蛋白的篩選,并從中獲得了一個(gè)新的ARF-6結(jié)合蛋白SAC-1。SAC-1是酵母磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1p在線蟲中的同源物。在線蟲極性腸上皮細(xì)胞中,ARF-6的缺乏會(huì)導(dǎo)致基底端內(nèi)體喪失SAC-1的標(biāo)記。貨物蛋白的穩(wěn)態(tài)分布實(shí)驗(yàn)顯示,SAC-1缺失會(huì)特異性地影響頂膜端的分泌運(yùn)輸途徑和基底端的循環(huán)運(yùn)輸途徑。在sac-1突變動(dòng)物中,PI(4,5)P2的水平以及ARF-6效應(yīng)因子UNC-16標(biāo)記的膜結(jié)構(gòu)都顯著增加,提示SAC-1可能是ARF-6的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),SAC-1能夠與ARF-6的GEF蛋白BRIS-1相互作用,并且BRIS-1與SAC-1的互作能夠以濃度依賴的方式減弱BRIS-1與無(wú)活性態(tài)ARF-6(GDP)的結(jié)合。因此,SAC-1缺失會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ARF-6(GDP)與GEF蛋白BRIS-1的相互作用。而在sac-1突變動(dòng)物中,敲降BRIS-1確實(shí)會(huì)降低PI(4,5)P2水平。值得注意...

【文章頁(yè)數(shù)】：106 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
第2章 材料和方法
    2.1 秀麗隱桿線蟲的基本培養(yǎng)方法
        2.1.1 飼養(yǎng)
        2.1.2 清潔
        2.1.3 凍存
        2.1.4 雜交
        2.1.5 顯微注射
    2.2 RNA干擾實(shí)驗(yàn)(RNAi)
    2.3 實(shí)驗(yàn)中使用的抗體
    2.4 CRISPR/Cas9 體細(xì)胞sac-1 基因敲除
    2.5 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
    2.6 GST pull-down實(shí)驗(yàn)
        2.6.1 GST標(biāo)簽蛋白的表達(dá)
        2.6.2 GST標(biāo)簽蛋白的純化
        2.6.3 HA標(biāo)簽蛋白的表達(dá)及結(jié)合
        2.6.4 SDS-PAGE
    2.7 載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因線蟲
    2.8 線蟲的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
    2.9 PIP免疫染色
    2.10 顯微成像和數(shù)據(jù)分析
第3章 研究結(jié)果
    3.1 SAC-1與ARF-6(GTP)和ARF-6(GDP)均相互作用
    3.2 SAC-1 在基底端點(diǎn)狀膜結(jié)構(gòu)上的定位依賴于ARF-6(GTP)
    3.3 在sac-1 突變體中CIE蛋白h TAC-GFP阻塞于早內(nèi)體
    3.4 SAC-1缺失影響腸上皮細(xì)胞頂膜端的分泌運(yùn)輸
    3.5 SAC-1 缺失導(dǎo)致PI(4,5)P2 水平急劇上升
    3.6 SAC-1 缺失引起的ARF-6 過(guò)激活導(dǎo)致PI(4,5)P2及h TAC-GFP累積
    3.7 SAC-1 缺失導(dǎo)致ARF-6和UNC-16 的胞內(nèi)累積
    3.8 SAC-1 缺失導(dǎo)致細(xì)胞連接蛋白HMP-1 定位異常
    3.9 SAC-1與ARF-6-GEF蛋白BRIS-1 相互作用
    3.10 SAC結(jié)構(gòu)域的催化活性喪失不影響結(jié)合BRIS-1
    3.11 SAC-1與ARF-6(T27N)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合BRIS-1/ARF-GEF
第4章 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述 ARF6 及其效應(yīng)產(chǎn)物PI(4,5)P2 調(diào)控內(nèi)吞運(yùn)輸
    內(nèi)吞運(yùn)輸?shù)闹饕緩?br>    Arf6調(diào)控囊泡循環(huán)運(yùn)輸
    PI(4,5)P2調(diào)控微絲動(dòng)態(tài)并促進(jìn)內(nèi)吞
    參考文獻(xiàn)
附錄A 轉(zhuǎn)基因和突變線蟲株
附錄B 常規(guī)試劑清單
附錄C 縮寫詞表
附錄D 發(fā)表論文
致謝



本文編號(hào)：3792136