蛋白質(zhì)組學(xué)是對器官、組織或細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模研究,其終極目標(biāo)為全面理解并重構(gòu)目標(biāo)蛋白質(zhì)組的構(gòu)成、功能及生物過程。其中,差異蛋白質(zhì)組學(xué)通過比較特定蛋白質(zhì)組在不同狀態(tài)下的差異來探究生理和病理機制,對于理解疾病發(fā)展、治療方法開發(fā)和臨床生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。蛋白質(zhì)的功能不僅與具體蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和含量密切相關(guān),還與蛋白質(zhì)間的相互作用和具體結(jié)構(gòu)形式直接相關(guān)。目前,差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究多采用shotgun(鳥槍法)分析策略,該策略在定性定量方面表現(xiàn)出極高的性能,但在完整蛋白質(zhì)到肽段的處理過程中不可避免會造成大量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用的破壞且難以追溯,而這些信息對于全面理解蛋白質(zhì)組的功能具有重要意義�；诖爽F(xiàn)狀,本文建立了基于一維凝膠電泳-液相色譜-質(zhì)譜(1DE-LC-MS)系統(tǒng)化分析的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略,利用1DE對蛋白結(jié)構(gòu)信息的保留和分離的高效性,及LC-MS/MS在大規(guī)模鑒定和定量上的高性能,實現(xiàn)對蛋白組學(xué)樣品的大規(guī)模差異分析,同時獲取與蛋白質(zhì)相互作用及蛋白質(zhì)降解等結(jié)構(gòu)相關(guān)的信息。該策略主要由五步構(gòu)成:1)非變性PAGE或SDS-PAGE分離樣品;2)針對每個樣品泳道平行切膠;...

【文章頁數(shù)】：234 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述
    1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究策略
        1.2.1 Top-down蛋白質(zhì)組學(xué)策略
        1.2.2 Bottom-up蛋白質(zhì)組學(xué)策略
        1.2.3 Hybrid(基于凝膠)蛋白質(zhì)組學(xué)策略
    1.3 定量與差異蛋白質(zhì)組學(xué)
        1.3.1 同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)
        1.3.2 非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)
    1.4 研究背景、內(nèi)容和意義
        1.4.1 研究背景
        1.4.2 研究內(nèi)容
        1.4.3 研究意義
第二章 1DE-LC-MS系統(tǒng)化分析的差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法的流程建立和條件優(yōu)化
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與儀器
        2.2.1 實驗動物
        2.2.2 實驗儀器與試劑
        2.2.3 相關(guān)溶液配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 平行梯度凝膠制備
        2.3.2 平行凝膠電泳
        2.3.3 平行切膠
        2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)化膠內(nèi)酶解
        2.3.5 CBB染色的必要性探究
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 平行制膠、平行電泳、平行切膠和標(biāo)準(zhǔn)化酶解流程的建立
        2.4.2 CBB染色對簡單樣品1DE-LC-MS分析的影響
        2.4.3 CBB染色對復(fù)雜樣品1DE-LC-MS/MS系統(tǒng)化分析的影響
        2.4.4 蛋白質(zhì)native1DE-MS-blots或 SDS-PAGE-MS blots的構(gòu)建
    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
第三章 非變性1DE-LC-MS系統(tǒng)化差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的建立及在人血漿/血清研究中的應(yīng)用
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與儀器
        3.2.1 實驗儀器與試劑
        3.2.2 相關(guān)溶液配制
    3.3 實驗方法
        3.3.1 人血漿和血清樣品準(zhǔn)備
        3.3.2 人血漿和血清蛋白的非變性一維凝膠電泳
        3.3.3 平行全泳道網(wǎng)格凝膠切取、膠粒編號及表觀分子量評估
        3.3.4 膠內(nèi)酶解及Nano LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集
        3.3.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析
        3.3.6 Western blot實驗
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 結(jié)合非變性PAGE分離,全泳道切膠和定量LC-MS/MS分析結(jié)果
        3.4.2 總蛋白native1DE-MS blots反應(yīng)整體蛋白分布
        3.4.3 蛋白質(zhì)native1DE-MS blots反應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息
        3.4.4 血漿和血清蛋白native1DE-MS blots的比較
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
第四章 SDS-PAGE-LC-MS系統(tǒng)化差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法建立及在腦缺血復(fù)灌損傷研究中的應(yīng)用
    4.1 引言
    4.2 實驗材料與儀器
        4.2.1 實驗動物
        4.2.2 實驗儀器與試劑
        4.2.3 相關(guān)溶液配制
    4.3 實驗方法
        4.3.1 局灶性大鼠腦缺血復(fù)灌損傷模型構(gòu)建
        4.3.2 動物分組及實驗設(shè)計
        4.3.3 動物模型成功性驗證
        4.3.4 大鼠腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)分析
        4.3.5 Western blot蛋白驗證
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 大鼠腦缺血復(fù)灌損傷模型驗證結(jié)果
        4.4.2 大鼠腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)整體評估
        4.4.3 大鼠腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)組的差異變化蛋白及Western blot驗證
        4.4.4 蛋白質(zhì)SDS-PAGE-MS blots反應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息
    4.5 討論
    4.6 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
    結(jié)論
    創(chuàng)新之處
    展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件



本文編號：3789246